产品名称：《猪细小病毒（PPV)检测试剂盒》；规格：48次检测；货号：PPV31；价格：720元。​

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Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.

《一步法恒温猪细小​病毒检测试剂盒》使用说明书 (版本OH02)

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货号

PPV31

储存条件

该产品在常温下运输，收到产品后请放于-20 ℃保存，该条件下，至少2年内仍然有活性。

产品用途

《一步法恒温猪细小病毒检测试剂盒》主要用于检测活体猪的肛门或者猪的肾、肺、脾脏、子宫等组织是否携带猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）。本产品仅用于基础研究。

产品简介

猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是引起妊娠母猪繁殖障碍的主要病原体之一，初产妊娠母猪感染后，经胎盘侵袭胚胎或胎儿，引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形及木乃伊化，致使母猪不孕或反复发情，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻。猪细小病毒在猪群中检出率甚高，在猪群中的血清抗体阳性率达50％～80％，给养猪业带来巨大的经济损失。PPV的快速诊断对于养猪业意义重大。

目前，PPV的诊断方法主要有：（一）病毒分离法。该方法由于费时费力而不适于临床的快速检测。（二）血清学方法。由于病毒感染特异性抗体出现较晚，血清学方法难以用于PPV的早期诊断。（三）PCR法。但是PCR法也有明显的缺点：（1）耗时，整个过程大约需要3个小时；（2）操作复杂，需要专业人员操作；（3）PCR产物的电泳，需要用到EB等潜在的致癌物质；（4）需要用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器。

相对于PPV的PCR法检测，《一步法恒温猪细小病毒检测试剂盒》有如下几个优点：（1）检测时间短，整个检测过程只需1小时；（2）操作极其简单，一步即可完成，整个检测过程完全可以由普通人员（比如普通养殖户）完成。（3）灵敏度高，是PCR法的10-1000倍，非常有利于疾病的早期诊断；（4）扩增的产物无需电泳，可以通过指示剂的颜色变化直接肉眼判断反应结果；（5）无需用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器，整个检测过程只需一个水浴锅。

试剂盒组成

（1）反应管，48个。

（2）水化溶液，1.5 mL 。

（3）阳性对照DNA，50 μL。

（4）矿物油，1.5 mL。

样品的准备

 活体猪的肛门拭子：使用无菌的棉签，来回蘸取猪的肛门数下（尽量将棉签插入猪的直肠内），将棉签放入含0.1 mL灭菌水的离心管内，搅动数下后，丢弃棉签。如果此时含肛门蘸取物的灭菌水太脏，可以低速离心（1000 rpm，离心5分钟）或者室温静止一段时间，然后取上清用于用于检测。如不立即检测，样品可于-20℃或-80℃保存。

 猪的组织：（1）将新鲜的或-80℃冻存的肾、肺、脾脏、子等组织，按照常规的哺乳动物组织基因组DNA提取试剂盒或者方法进行提取，最后用灭菌水溶解提取好的DNA（注意：不得使用含EDTA的溶液进行溶解！否则会影响恒温扩增的酶活性）。如不立即检测，样品可于-20℃或-80℃保存。（2）如果是已经提取并溶解在TE（1 mM EDTA，10 mM Tris-HCl）的病料组织基因组DNA，请用灭菌去离子稀释100倍（目的是使其中的EDTA含量低于0.05mM）后，再进行检测。

检测过程

1. 反应：操作之前，请详细阅读后文的注意事项后，再进行操作。

（1） 取反应管，分别标记为阳性对照管（Positive）、测试管（Test）和阴性对照管（Negative），而后各加入25 μL的水化溶液，吹吸数次直到所有冻干粉剂彻底溶解（冻干品较难溶解，需要缓慢吹吸约30-50下。此过程，如有大气泡产生或者小气泡过多，必须去除，否则严重影响反应结果！气泡的去除方法请见注意事项），将所有反应管盖子盖上，在另外一个房间内进行下一步的操作。

（2） 往阳性对照管中加入1 μL阳性对照DNA，而往测试管中加入1 μL待测样品，阴性对照管可以不加。

（3） 选择以下方式之一进行反应：① 水浴内反应：往每个反应管内加入25 μL矿物油，以防止水份挥发，盖上盖子，将反应管插入带孔的漂板内，放入已经升温到63℃的水浴内，准确反应53分钟。② PCR仪上反应：有PCR仪的实验室，尽量在PCR仪上进行反应，这样可以准确控制反应的时间和温度。PCR仪参数如下：63℃，53 min；20℃, ∞；热盖温度，100 ℃。注：在带热盖的PCR仪上进行反应，无需在反应管内加入矿物油。

2. 结果判断：63℃反应53分钟后，立刻取出反应管，放于室温。以一张白纸或白色泡沫盒（优选白色泡沫）为背景，通过反应管溶液颜色的变化，即可判断检测结果。如果溶液为蓝绿色，则说明样品中存在猪细小病毒；如果为粉红色或紫红色，则说明样品中没有猪细小病毒（如图1）。

 注意：如果63℃反应53分钟后，阳性对照没有呈现蓝绿色，说明酶活性由于某种原因有所下降，可以考虑再在63℃反应5分钟。如果63℃反应53分钟后，阳性对照已经呈现蓝绿色，不得再继续反应，否则会出现假阳性。

图1. 左边为阴性反应​结果，右边为阳性反应结果。

注意事项

1. 冻干品较难溶解，需要缓慢吹吸约30-50下，由于水化液中含有表面活性剂，吹吸过程很容易产生气泡，如图2A所示的液体表面少量小气泡不影响反应结果。但是如果小气泡过多或者有图2B所示的大气泡产生，则会严重影响反应结果，必须去除！气泡去除方法：（一）盖上盖子，将反应管套在0.5 mL的管子内，再将0.5 mL的管子套入1.5 mL的管子内，同时剪掉0.5 mL和1.5 mL的离心管盖子，在普通台式离心机上，≧13000 rpm,离心1分钟。（二）盖上盖子，将反应管用手指捏住，用力甩动数下。经验证，此方法可以去除几乎所有的大气泡，但是无法去除小气泡。（三）将反应管在室温静置20-30分钟，大部分气泡可以自动消失。注：条件许可，尽量采取第一种方式去除气泡。

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图2. (A)液体表面的少量小气泡，不影响反应;（B）大气泡，严重影响反应，必须去除。

2. 如果一次同时进行大批量的检测（一次检测超过30个样品），可以采取以下方式溶解冻干粉：直接往每个反应管中加入25 μL的水化溶液（每加一管，更换新的吸头，以此保证每次移液的准确性，同时防止将整管水化液污染），无需吹吸，盖上盖子后，室温静置15分钟以上（让冻干粉充分水化），用左手拇指和食指捏住反应管的上部，用右手食指轻弹反应管的底部，使冻干粉彻底溶解。如果冻干粉无法彻底溶解，可以再在室温静置5分钟，重复该操作。该方法有两个优点：（1）由于无需吹吸，不容易产生气泡；（2）进行大批量检测时，可以节约很多时间。

3. 由于恒温扩增所用的各种酶强烈依赖溶液中的二价离子，请确保所检测的DNA样品没有EDTA等金属离子螯合剂（样品中EDTA浓度不能超过0.05 mM，最好没有）。所以：（1）请用去离子水溶解提取好的样品DNA；（2）如果是已经提取并溶解在TE（1 mM EDTA，10 mM Tris-HCl）的病料组织基因组DNA，请用灭菌去离子稀释100倍（目的是使其中的EDTA含量低于0.05mM）后，再进行检测。

4. 请确保反应之前：阴性、阳性和所有待测样品的颜色基本一致。如果个别样品，一旦加入，反应管的颜色就与阴性、阳性明显不同，说明其中含有可干扰本系统正常指示效果的物质，必须先去除或稀释。稀释方法：用灭菌水稀释10-100倍后，再尝试。

5. 在反应之前，水浴锅必须先升温到63℃，再放入反应管。此外，必须用水银温度计测量水温，确保水浴锅的温度准确。

6. 在63℃反应的时间必须准确计时，超过说明书规定的反应时间，可能会出现假阳性。个别批次的最佳反应时间，可能会围绕53分钟上下略有变化，如有变化，会在试剂盒中特别提醒。如果没有特别提醒，请按此说明书进行反应，即61℃，反应53分钟。

7. 防DNA污染注意事项：（1）必须确保吸取水化液的移液枪本身没有残留的PPV。因此，最好使用全新购买的移液枪。如果没有新购买的移液枪，至少应该使用没有进行过PPV核酸抽提的移液枪吸取水化液。因为进行过PPV核酸抽提的移液枪极有可能被PPV污染。由于本试剂盒非常灵敏，移液枪中吸附的微量PPV有可能造成不必要的假阳性。（2）最好使用带滤芯的吸头吸取水化液、阳性对照和待测样品。如果没有带滤芯的吸头，至少应该使用新开封的吸头。（3）吸取水化液并溶解冻干粉的房间，与用于样品前处理、加阳性对照DNA、样品DNA的房间一定要分开。（4）样品前处理的各类吸头、棉签、离心管，以及吸取阳性对照DNA、待测样品DNA的吸头，务必小心处理，请将其装入含有半瓶水的带盖的、可密封的瓶子内，全部样品吸取完后，盖上瓶盖，以防止阳性DNA的挥发，造成环境的污染，从而干扰检测结果。（5）反应后，请勿打开反应管的盖子，否则有可能造成检测环境的污染。结果判断完后，将其用自封袋密闭，扔到另外一个房间的垃圾桶内。

8. 反应结束后可以拍成彩色照片，作为检测结果依据。由于用手机拍的照片颜色失真很厉害，拍照时请尽量用专业的数码相机并带闪光拍照（如果没有闪光，至少在光照条件好的窗口或者台灯下拍照）这样阳性和阴性的色彩区分更好。

9. 由于光照、是否开闪光以及各个相机的不同，阳性和阴性的拍照效果可能会与本说明书的图示效果（图1）略有不同，但不会影响到结果的判断。只要一个反应管呈明显的蓝绿色，说明为阳性反应结果；而阴性反应可能会略有差异，只要总体呈粉红色或紫红色，则说明为阴性反应结果。总之，反应后，阳性和阴性的颜色必须一眼就能看出区别，才说明检测成功。