​上海易色医疗科技有限公司

Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.


 一、《PCR法支原体检测试剂盒》说明书​​


《PCR法支原体检测试剂盒》说明书(版本190718)


PDF说明书,请到本网站下载中心”页面下载!



货号

    PM008


储存条件

    该产品在常温或随冰袋运输,收到产品后,请立即放-20 ℃冰箱低温保存。该条件下,至少5年内有效。


产品用途

    《PCR法支原体检测试剂盒》可用于检测一切可能含支原体的样品,比如:(1)体外细胞培养的上清;(2)血清;(3)各种体液,如唾液、尿液、鼻腔分泌物等;(4)别的液体样品。本产品仅供研究使用。


产品简介

    哺乳动物细胞的培养,支原体(Mycoplasma)污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数,导致实验结果的不准确、甚至完全错误(支原体污染对细胞的详细危害,请参考本公司的网站:www.yisemed.com)。从2013年开始,《Nature》期刊已正式要求投稿的文章,如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。

    培养法是相对可靠的支原体检测技术,但是该方法非常耗时的,需要数周,不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外,通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体,即猪鼻支原体(M.Hyorhinis)。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20-50%。

    有的实验室使用荧光染色法检测支原体,但是该方法灵敏度太低,当检测成阳性时,细胞经常已经严重污染。

    本公司已经开发出了专用于体外细胞培养的《一步法恒温支原体检测试剂盒》,与PCR法支原体检测相比,其具有许多优点:耗时短、灵敏度高、操作简单、不会被细胞代谢产物抑制、结果无需电泳肉眼可直接判断等。

    尽管如此,《一步法恒温支原体检测试剂盒》可能也有个小缺点:因为《一步法恒温支原体检测试剂盒》需要至少同时使用4条引物才能完成扩增,其引物设计相对困难。虽然经我们测试,该试剂盒至少可认识其说明书中列举的13种支原体,而这13种支原体大约占污染细胞的支原体种类的99%左右。但是,不排除《一步法恒温支原体检测试剂盒》无法识别个别在体外细胞培养中出现概率极低的支原体。为此,我们特意开发了具有广谱识别能力的《PCR法支原体检测试剂盒》。

    经测试,本公司开发的《PCR法支原体检测试剂盒》至少可以识别在体外细胞培养中曾经报道出现的20种支原体,根据文献报道,这些支原体基本上占污染细胞的支原体种类的100%。具体如下:(1)M. hyorhinis、(2)M. fermentans、(3)M. arginini、(4)M. hominis、(5)M. orale、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)Acholeplasma laidlawii、(9)M. agalactiae、(10)M. bovis、(11)  M. bovoculi、(12)Acholeplasma axanthum、(13)M. buccale、 (14) M. pneumoniae、(15)M. arthritidis、(16)M. pulmonis、(17)M. gallisepticum、(18)M. gallinarum、(19)M. canis、(20)Ureaplasma urealyticum(注:M.为Mycoplasma的缩写)。如果客户发现除上述20种支原体外,还有其他的支原体也会污染体外培养的细胞,或者客户纯粹就是想检测其他的支原体,请告诉我们支原体的名称,我们将进行序列比对,然后告诉你本试剂是否可以识别。此外,根据支原体DNA的序列,本试剂盒可以识别100多种至今已发现的支原体,具有广谱的识别能力。

    此外,作为支原体检测领域的共识,单独使用任何一种支原体检测方法,都无法做到100%正确,既不会漏检(假阴性),也不会多检(假阳性)。严格的支原体检测,至少需要使用两种(最好使用三种)不同原理的支原体检测方法同时进行检测,才能使检测结果接近100%正确。

    如果您想得到100%正确的支原体检测结果(比如,开展细胞治疗的客户,进行干细胞培养的客户,生产血清、胰酶、培养液的客户,出售各种原代培养细胞系和肿瘤细胞系的客户等),任选本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》和《发光法支原体检测试剂盒》中的两种进行检测,将会得到比较满意的结果,检测的正确率应该在99.9%以上。如果同时使用这三种试剂盒进行检测,检测的正确率应该在99.99%以上。

    如果将所有待测样品统一接种到支原体液体培养基,然后在37℃培养箱中培养3天后,再用本公司三种支原体检测试剂盒同时进行检测,则基本可以确保您的检测结果100%正确。 通过将待测样品接种到支原体液体培养基培养3天的目的是:防止一些支原体含量极其微量的待测样品(比如:细胞培养用的血清、胰酶、抗生素、培养液和极个别的细胞培养上清),如果不经过大量繁殖,有可能漏检。


试剂盒组成

(1) 支原体引物和内参(100次):206 μL;

(2) 阳性支原体DNA:50 μL

 注意1:本试剂盒提供的支原体引物和内参可供100次支原体检测使用。

注意2以下试剂需要自己准备:(1)灭菌的去离子水;(22.5 mMdNTP;(3)普通的Taq DNA 聚合酶和相应的缓冲液【比如,Takara公司的普通Taq酶,货号:R001A(可用100次)或R001B(可用400次),内含2.5 mMdNTP。】;(46× DNA上样缓冲液【也可以购买本公司生产的5× AgarOrange超级DNA上样缓冲液,该缓冲液已含核酸染料,不需要接触EB等致癌物质!】。

      注意3:本试剂盒不推荐使用Pfu等具有矫正功能的高保真DNA聚合酶。因为高保真DNA聚合酶扩增能力一般比普通的Taq DNA 聚合酶差!


检测过程

1、 待测样品的准备

      为了准确判断细胞是否有支原体的污染,待测的细胞培养液样品最好来源于至少培养2天(最好3天)且汇合度在70-90%左右的细胞培养液上清(贴壁细胞)。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后,至少让细胞生长2天(最好3天)再取培养液进行检测。取150 μL上述待测样品到1.5 mL离心管内,在普通台式离心机上1200 rpm (大约150-200 g)离心5 min,取离心后的上清100 μL用于支原体检测,丢弃下层剩余的50 μL(含细胞沉淀)。

收集并已经离心去除细胞的待测样品如果不立即检测,请放于-20℃或-80℃冰箱保存,不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月,在-80℃基本可以长期保存。


       注意:本步骤的低速离心是为了去除哺乳动物细胞,以排除其不必要的干扰。所以离心力要严格控制在150-200 g,该离心力下,哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会。如果错误使用更高的离心力将可能导致支原体也被离心下来,从而导致假阴性。


2、 PCR体系的配制

请按下表(表1)进行PCR体系(总体积25 μL)的配制:
































      注意1:本试剂盒不推荐使用2×的PCR mixture(内含Taq酶、缓冲液和dNTP),建议使用普通Taq酶、10×Taq缓冲液和dNTP等试剂自己配置PCR体系。

       注意2:PCR的反应体积(25 μL)、支原体引物和内参的体积(2 μL)、阳性支原体DNA或待测样品的体积(2 μL),这是经过优化后的最佳体积,不能随意增加或减少,否则检测结果容易不稳定,甚至完全扩增不出来。如果使用2x的PCR mixture,那么PCR的反应体系(25 μL)应该按照如下进行配置:2×的PCR mixture(12.5 μL)、支原体引物和内参的体积(2 μL)、阳性支原体DNA或待测样品的体积(2 μL),然后用去离子水补足到总体积25 μL。

      注意3:PCR体系的配制应该在冰上进行操作。


3、 PCR设置参数

1 cycle        94 ℃ for 2 minutes

35 cylses    94 ℃ for 20 seconds

                  55 ℃ for 20 seconds

                  72 ℃ for 60 seconds

1 cycle       72 ℃ for 5 minutes

1 cycle        8 ℃ forever


 注意:PCR的循环数不能增加或减少,35个循环是最理想的循环数。别的参数也请不要更改,否则可能导致内参或阳性条带扩增失败。





4、 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

(1) 配制含溴化乙锭(EB)的浓度为1.5%的DNA琼脂糖凝胶【注:(1)如果不想接触强致癌物EB,可以使用本公司生产的5× AgarOrange超级DNA上样缓冲液,使用该产品无需在凝胶中预先加入核酸染料。具体使用方法,请参见本公司网站的说明书。(2)琼脂糖凝胶的最佳浓度为1.5%,此浓度下,条带分离效果最好。】

(2) 往每个PCR管内加入5 μL 6× DNA上样缓冲液。

(3) 取上述含DNA上样缓冲液的PCR产物10 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。

(4) 当溴酚蓝染料跑出3厘米左右时,停止电泳,拍照。



结果判断


    PCR扩增的结果有可能出现以下几种情况(表2):

































注意事项


1、 每次检测都应该设有阴性对照,作用有:

(1)由于有效的PCR扩增,阴性对照也会有一条586 bp的内参条带,这样可以保证本试剂盒含有的支原体引物和内参以及自己准备的Taq DNA 聚合酶,dNTP等试剂没有问题;

(2)只有当阴性对照的结果没有出现270 bp左右的支原体特异条带时,其他样品的检测结果才是可信的。


2、 每次试验阴性对照中586 bp的内参条带都必须出现而且要有一定的亮度,才说明试验成功。如果阴性对照的内参条带经常没有出现或者非常弱,说明试验不成功,这时可以采取以下两个措施:

(1) 确认一下:使用的是否是没有矫正功能的普通Taq DNA 聚合酶。本试剂盒不推荐使用Pfu等具有矫正功能的高保真DNA聚合酶,因为高保真DNA聚合酶扩增能力一般比普通的Taq DNA 聚合酶差!

(2) 可以尝试增加PCR的循环数,比如:由原来的35个循环,增加到40个循环。

如果采取以上两个措施后,阴性对照的内参条带仍然经常没有出现或者非常弱,请联系厂家解决。


3、 如果直接使用细胞培养液上清进行检测,而检测结果显示该样品586 bp条带和270 bp左右的条带都没有出现(如图1,泳道6)或者内参条带非常微弱,在排除PCR试剂的问题后(即阴性对照可以正常扩增),说明该样品含有抑制PCR扩增的代谢产物。

有关PCR的扩增会被细胞的代谢产物抑制的问题,Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit(货号MP0035)的PCR法支原体检测试剂盒说明书中也特别提到了这点,说明这是一个PCR法支原体检测中经常遇到的问题,其强烈建议用试剂盒进行DNA提取后再进行鉴定。这也是PCR法支原体检测的致命弱点。

为了克服该问题,您购买的PCR法支原体检测试剂盒,其扩增产物中必须含有内参(Internal Contol)条带作为对照【本试剂盒的586 bp条带就是内参条带】。否则,如果没有内参作为对照,即使样品扩增后没有支原体特异条带,你也无法确定是因为样品确实没有支原体还是因为PCR被细胞的代谢产物抑制导致的假阴性。

如果出现PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制时,可以采取以下几种措施:

(1) 将取样的时间提前到换液后2天或3天,此时细胞上清的PCR扩增抑制物相对比较少,一般不会产生严重的抑制。

(2) 用PBS对待测样品直接进行稀释,比如取10 μL上清,加90 μL PBS,然后取稀释后的样品2 μL进行检测。

(3) 用PBS对待测样品进行离心清洗,去除样品中的抑制物。具体方法如下:取1 mL细胞上清,先13000 rpm离心5 min,吸走950 μL上清;加PBS 950 μL,再次离心,吸走950 μL上清;再加PBS 950 μL,第三次离心,吸走950 μL上清;吹匀剩余的50 μL,取2 μL进行检测。但是该方法有如下缺点:第一,如果样品支原体含量较少,离心清洗可能导致漏检,因为离心清洗过程中,可能导致支原体部分丢失。第二,个别样品,即使经过上述清洗也无法彻底去除抑制剂。

(4) 使用血液基因组DNA抽提试剂盒(建议使用离心柱法或者磁珠法血液基因组DNA抽提试剂盒),抽提细胞上清的支原体DNA后再进行PCR鉴定。注:为了预防PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制的问题,也可以考虑将所有待测样品全部进行DNA提取后,再使用本试剂盒进行检测。

(5) 使用本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》或者《发光法支原体检测试剂盒》进行检测,经测试,该两种试剂盒的检测都不会被细胞的代谢产物所抑制。


4、 如发现细胞被支原体污染,本公司提供细胞专用支原体清除和预防试剂。


5、 防DNA污染注意事项:

(1) “PCR体系配制的房间、移液枪”(不要使用细胞培养室的移液枪!)和“PCR产物的电泳房间、移液枪”一定要分开,不能在同一个房间进行,也不能使用相同的移液枪进行操作。

(2) PCR产物是导致假阳性的最主要原因,PCR产物不要在PCR体系配制的房间中打开。

(3) 样品处理的房间和移液枪,如有条件,最好也分开。

(4) 建议使用滤芯吸头进行操作。

(5) 收到的支原体引物和内参,可以分装(比如50微升一支)后保存。

(6) 如果发现阴性对照也出现阳性条带,说明发生DNA污染,必须将PCR所有的试剂、引物和水都换掉。


6、 支原体检测样品可以分成两类:(1)用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液,由于该条件非常适合支原体生长,培养数天后,支原体密度一般较高,可达107-9/mL,建议直接检测;(2)低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品,由于这些样品即使有支原体污染,支原体含量一般很少,直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测,往往检测不出来。这些样品建议使用支原体液体培养基(必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基)培养3-7天后,再进行检测。具体方法请参考本公司《发光法支原体检测试剂盒》说明书中最后的注意事项部分。




PCR法支原体检测试剂盒体系的配制
 二、各公司《PCR法支原体检测试剂盒》选购注意事项



各公司《PCR法支原体检测试剂盒》选购注意事项


目前,PCR法支原体检测仍然是支原体快速检测领域被客户选购最多的方法。目前,商业化的PCR法支原体检测方法就有好几种,各优缺点分述如下:


 (1)不带内参基因的普通PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有2条引物,不带内参基因。通过30-35轮的普通PCR直接检测。需要通过琼脂糖电泳分析检测结果,整个检测过程耗时3-4小时。缺点:无法区分真阴性样品和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品(二者,支原体特异条带均为阴性)。


 (2)带内参基因的普通PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有2条引物,带内参基因。通过30-35轮的普通PCR直接检测。需要通过琼脂糖电泳分析检测结果,整个检测过程耗时3-4小时。优点:可以区分真阴性样品(内参条带为阳性而支原体特异条带为阴性)和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品(内参条带和支原体特异条带均为阴性)。


 (3)巢式PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有4条引物,一般不带内参基因。第一轮,用2条外引物通过30轮的PCR扩增后;第二轮,取少量第一轮的扩增产物作为模板,用2条内引物再进行30轮的PCR扩增。需要通过琼脂糖电泳分析检测结果,整个检测过程耗时6-8小时。缺点:耗时太久,容易产生假阳性、也无法区分真阴性样品和假阴性样品


 (4)定量PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有2条引物,不带内参基因。通过40轮的定量PCR检测。无需通过琼脂糖电泳分析检测结果,整个检测过程耗时2-3小时。缺点:无法区分真阴性样品和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品(二者,均显示为没有扩增)。


由于PCR法支原体检测过程中,PCR的扩增可能会被细胞的代谢产物抑制的问题,是该方法的致命弱点。Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit(货号MP0035)的PCR法支原体检测试剂盒说明书中也特别提到了这点,说明这是一个PCR法支原体检测中经常遇到的问题,其强烈建议用试剂盒进行DNA提取后再进行鉴定。


 上述4种PCR支原体检测方法中,只有方法(2)可以区分真阴性样品(内参条带为阳性而支原体特异条带为阴性)和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品(内参条带和支原体特异条带均为阴性)。所以,大家选购各公司的PCR法支原体检测试剂盒时,尽量选取含内参基因的上述方法(2)类的支原体检测试剂盒,比如本公司的《PCR法支原体检测试剂盒》(货号:PM008)和Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit(货号:MP0035)。









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 三、产品价格​​和价格对比


产品名称:《PCR法支原体检测试剂盒》;货号:PM008;价格:1200元/100次;平均每个样品12元。


价格对比:以Sigma公司的​​​LookOut® Mycoplasma PCR Detection Kit(货号MP0035)为例,2014年目录价为3469元/24次检测,每次检测约需145元。国内其他品牌的PCR法支原体检测试剂盒,每次检测也普遍需要30-50元。

 


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