​上海易色医疗科技有限公司

Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.


 一、《PCR法支原体检测试剂盒》说明书​​

​《PCR法支原体检测试剂盒》说明书(版本20200915)


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货号

      PM008

包装规格

      100次/盒

储存条件

      该产品在常温或随冰袋运输,收到产品后,请立即放-20 ℃冰箱低温保存。该条件下,至少5年内有效。

产品用途

      《PCR法支原体检测试剂盒》(PCR Mycoplasma Detection Kit)可用于检测一切可能含支原体的样品,比如:(1)体外细胞培养的上清;(2)血清;(3)各种体液,如唾液、尿液、鼻腔分泌物等;(4)别的液体样品。本产品仅供研究使用。


产品简介

      哺乳动物细胞的培养,支原体(Mycoplasma)污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数,导致实验结果的不准确、甚至完全错误(支原体污染对细胞的详细危害,请参考本公司的网站:www.yisemed.com)。从2013年开始,《Nature》期刊已正式要求投稿的文章,如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。

      培养法是相对可靠的支原体检测技术,但是该方法非常耗时的,需要数周,不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外,通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体,即猪鼻支原体(M.Hyorhinis)。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20-50%。

      有的实验室使用荧光染色法检测支原体,但是该方法灵敏度太低,而且严重依赖实验人员的经验,实验的稳定性极差。此外,当该方法检测成阳性时,细胞经常已经严重污染。

培养法和荧光染色法虽然是我国药典收录的支原体检测方法,但是因为其各自都有明显的缺点,不适合作为支原体快速检测的方法。

      本公司目前已经开发出四种不同原理的快速支原体检测试剂盒,分别是:《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》,其各自都有自己的优缺点(详情请参考本公司网站)。

      本公司开发的《一步法恒温支原体检测试剂盒》具有许多优点:配套仪器简单、耗时短、灵敏度高、操作简单、不会被细胞代谢产物抑制、结果无需电泳肉眼可直接判断等。

      尽管如此,《一步法恒温支原体检测试剂盒》可能也有个小缺点:因为《一步法恒温支原体检测试剂盒》需要至少同时使用4条引物才能完成扩增,其引物设计相对困难。虽然经我们测试,该试剂盒至少可认识其说明书中列举的13种支原体,而这13种支原体大约占污染细胞的支原体种类的99%左右。但是,不排除《一步法恒温支原体检测试剂盒》无法识别个别在体外细胞培养中出现概率较低的支原体。为此,我们特意开发了具有广谱识别能力的《PCR法支原体检测试剂盒》。

      《PCR法支原体检测试剂盒》具有100%支原体识别率、灵敏度高、含内参条带从而可以区分真阴性样品和假阴性样品、无需配套昂贵的荧光定量PCR仪等优点,是普通实验室支原体检测最常用的方法之一。

      经测试,本公司开发的《PCR法支原体检测试剂盒》至少可以识别在体外细胞培养中曾经报道出现的20种支原体,根据文献报道,这些支原体基本上占污染细胞的支原体种类的100%。具体如下:(1)M. hyorhinis、(2)M. fermentans、(3)M. arginini、(4)M. hominis、(5)M. orale、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)Acholeplasma laidlawii、(9)M. agalactiae、(10)M. bovis、(11)  M. bovoculi、(12)Acholeplasma axanthum、(13)M. buccale、 (14) M. pneumoniae、(15)M. arthritidis、(16)M. pulmonis、(17)M. gallisepticum、(18)M. gallinarum、(19)M. canis、(20)Ureaplasma urealyticum(注:M.为Mycoplasma的缩写)。如果客户发现除上述20种支原体外,还有其他的支原体也会污染体外培养的细胞,或者客户纯粹就是想检测其他的支原体,请告诉我们支原体的名称,我们将进行序列比对,然后告诉你本试剂是否可以识别。此外,根据支原体DNA的序列,本试剂盒可以识别100多种至今已发现的支原体,具有广谱的识别能力。

      此外,作为支原体检测领域的共识,单独使用任何一种支原体检测方法,都无法做到100%正确,既不会漏检(假阴性),也不会多检(假阳性)。严格的支原体检测,至少需要使用两种(最好使用三种)不同原理的支原体检测方法同时进行检测,才能使检测结果接近100%正确。

      如果您想得到100%正确的支原体检测结果(比如,开展细胞治疗的客户,进行干细胞培养的客户,生产血清、胰酶、培养液的客户,出售各种原代培养细胞系和肿瘤细胞系的客户等),任选本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》中的两种进行检测,将会得到比较满意的结果。如果几种不同支原体检测方法的检测结果一致,正确率几乎就是100%。


试剂盒组成

(1) 支原体引物和内参(100次):206 μL;

(2) 阳性支原体DNA:50 μL

 注意1:本试剂盒提供的支原体引物和内参可供100次支原体检测使用。

 注意2:以下试剂需要自己准备:(1)灭菌的蒸馏水或去离子水【请使用普通蒸馏水或去离子水。不能使用去内毒素的水、DEPC处理的水或者商品化的DNase/RNase-free的水,这几种水都可能会抑制PCR扩增的效率。】;(2)2.5 mM的dNTP;(3)普通的Taq DNA 聚合酶和相应的缓冲液【比如,Takara公司的普通Taq酶,货号:R001A(可用100次)或R001B(可用400次),内含2.5 mM的dNTP。如果个别样品有非特异性扩增,可以考虑使用TaKaRa Taq™ Hot Start Version,货号:R007A(可用100次)】;(4)6× DNA上样缓冲液【也可以购买本公司生产的5× AgarOrange超级DNA上样缓冲液,该缓冲液已含核酸染料,不需要接触EB等致癌物质!】。

 注意3:本试剂盒不推荐使用Pfu等具有矫正功能的高保真DNA聚合酶。因为高保真DNA聚合酶扩增能力一般比普通的Taq DNA 聚合酶差!


检测过程

1、 待测样品的准备

为了准确判断细胞是否有支原体的污染,待测的细胞培养液样品需要取自换液后培养2-3天且汇合度在90%左右的细胞培养液上清(贴壁细胞)。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后,让细胞生长2-3天再取培养液进行检测。取150 μL上述待测样品到1.5 mL离心管内,在普通台式离心机上1000 rpm (大约150 g)离心5 minutes,取离心后的上清100 μL用于支原体检测,丢弃下层剩余的50 μL(含细胞沉淀)。

已经离心去除细胞的待测样品可以直接检测,也可以进行热处理后再检测,具体如下:95 ℃加热处理10 minutes(可以转移到PCR管内,在PCR仪上进行加热处理),简单离心(1000 g,5 seconds)后,取上清进行检测。

已经离心去除细胞的待测样品如果不立即检测,请放于-20 ℃或-80 ℃冰箱保存,不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月,在-80℃基本可以长期保存。

本试剂盒可以直接使用经上述处理的细胞培养液上清进行检测(这种样品,存在PCR扩增被抑制的可能),也可以使用DNA抽提试剂盒提取样品的DNA后再进行检测(这种样品,PCR扩增不会被抑制)。详细情况参考本说明书的注意事项部分。

 注意1:本步骤的低速离心是为了去除哺乳动物细胞,以排除其不必要的干扰。所以离心力要严格控制在150-200 g,该离心力下,哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会。如果错误使用更高的离心力将可能导致支原体也被离心下来,从而导致假阴性。

 注意2:取样的时间,最好取自细胞换液后2-3天,如果样品取自换液后培养时间很长的上清,细胞上清中积累的PCR扩增抑制物会大量增加,导致用本试剂盒进行支原体PCR检测时,因为整个PCR扩增被抑制,导致内参条带也无法扩增。据我们测试,换液后5-7天,PCR扩增抑制物就已经大量积累。

 注意3::如果预期待测样品支原体含量较少(比如,低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等),可以采取措施以提高检测的灵敏度,具体方法请看后文注意事项部分:如果提高本试剂盒检测灵敏度。

2、 PCR体系的配制【本步骤所有操作强烈建议使用进口滤芯吸头(比如Axygen滤芯吸头)进行操作,以避免试剂被污染。操作之前,请认真看完后文的注意事项后,再进行操作】:

2.1如果样品总数为N(N=待测样品数+1个阳性对照+1个阴性对照),请按下表(表1)进行PCR体系(总体积25 μL)的配制:


表1.PCR扩增体系的配制

                                                                          单个样品体积            样品总数                  总体积

去离子水                                                             15.5 μL                         N                    15.5×N×1.06 μL

10×Taq DNA 聚合酶缓冲液(含Mg2+)                  2.5 μL                          N                     2.5×N×1.06 μL

2.5 mM dNTP                                                       2.5 μL                          N                     2.5×N×1.06μL

5 Units/μL Taq DNA 聚合酶                                 0.5 μL                           N                      0.5×N×1.06 μL

支原体引物和内参                                                   2 μL                          N                        2×N×1.06 μL


 注意1:总体积中多配制6%(客户如果觉得该比例不合适,可以自己调整),是为了防止移液误差,以保证每个反应管中的反应液足量。

 注意2: PCR体系的配制应该在冰上进行操作。

 注意3:本试剂盒不推荐使用2×的PCR mixture(内含Taq酶、缓冲液和dNTP),建议使用普通Taq酶、10×Taq缓冲液和dNTP等试剂自己配置PCR体系。

 注意4: PCR的反应体积(25 μL)、支原体引物和内参的体积(2 μL)、阳性支原体DNA或待测样品的体积(2 μL),这是经过优化后的最佳体积,不能随意增加或减少,否则检测结果容易不稳定,甚至完全扩增不出来。如果使用2x的PCR mixture,那么PCR的反应体系(25 μL)应该按照如下进行配置:2×的PCR mixture(12.5 μL)、支原体引物和内参的体积(2 μL)、阳性支原体DNA或待测样品的体积(2 μL),然后用去离子水补足到总体积25 μL。

2.2将上述配制好的PCR反应体系,吹打均匀后,按每管23 μL分装到0.2 mL的PCR管中。

2.3 待测样品管加入2 μL待测样品,阴性对照管加入2 μL去离子水,阳性对照管加入2 μL阳性支原体DNA。每管反应液的总体积为25 μL。

 注:1)装有阳性支原体DNA的螺口管请不要高速离心,开盖之前,只要用手指捏住,用力甩一下即可。吸取之前,请吹吸均匀后再吸取。如果不小心高速离心了,务必吹吸均匀后再吸取。2)进行反应体系配制的房间,与样品前处理、加阳性对照DNA、样品DNA的房间最好分开。

3、 PCR设置参数

1 cycle        94 ℃ for 2 minutes

35 cycles     94 ℃ for 20 seconds

                   55 ℃ for 20 seconds

                  72 ℃ for 50 seconds

1 cycle      72 ℃ for 5 minutes

1 cycle       8 ℃ forever

 注意:PCR过程中,正常情况下35个循环是比较理想的循环数。别的参数也请不要更改,否则可能导致内参或阳性条带扩增失败。

4、 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

(1) 配制含溴化乙锭(EB)的浓度为1.5%的DNA琼脂糖凝胶【注:(1)如果不想接触强致癌物EB,可以使用本公司生产的5× AgarOrange超级DNA上样缓冲液,使用该产品无需在凝胶中预先加入核酸染料。具体使用方法,请参见本公司网站的说明书。(2)琼脂糖凝胶的最佳浓度为1.5%,此浓度下,条带分离效果最好。】

(2) 往每个扩增后的PCR管内加入5 μL 6× DNA上样缓冲液。

(3) 取上述含DNA上样缓冲液的PCR产物10 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。

(4) 当溴酚蓝染料跑出上样孔3-5厘米左右时,停止电泳,拍照。

结果判断

PCR扩增的结果有可能出现以下几种情况(表2):































注意事项


1、 每次检测都应该设有阴性对照,作用有:


(1)由于有效的PCR扩增,阴性对照也会有一条586 bp的内参条带,这样可以保证本试剂盒含有的支原体引物和内参以及自己准备的Taq DNA 聚合酶,dNTP等试剂没有问题;


(2)只有当阴性对照的结果没有出现270 bp左右的支原体特异条带时,其他样品的检测结果才是可信的。


2、 每次试验阴性对照中586 bp的内参条带都必须出现而且要有一定的亮度,才说明试验成功。如果阴性对照的内参条带经常没有出现或者非常弱,说明试验不成功,这时可以采取以下几个措施:


(1) 请使用普通蒸馏水或去离子水。不能使用去内毒素的水、DEPC处理的水或者商品化的DNase/RNase-free的水,这几种水都可能会抑制PCR扩增的效率。


(2) 确认一下:使用的是否是没有矫正功能的普通Taq DNA 聚合酶。本试剂盒不推荐使用Pfu等具有矫正功能的高保真DNA聚合酶,因为高保真DNA聚合酶扩增能力一般比普通的Taq DNA 聚合酶差!


(3) 可以尝试增加PCR的循环数,比如:由原来的35个循环,增加到40-45个循环。


如果采取以上两个措施后,阴性对照的内参条带仍然经常没有出现或者非常弱,请联系厂家解决。


3、 如果个别样品有非特异性扩增,可以考虑使用TaKaRa Taq™ Hot Start Version,货号:R007A(可用100次)。


4、 如果直接使用细胞培养液上清进行检测,而检测结果显示该样品586 bp条带和270 bp左右的条带都没有出现(如图1,泳道6)或者内参条带非常微弱,在排除PCR试剂的问题后(即阴性对照可以正常扩增),说明该样品含有抑制PCR扩增的代谢产物。


有关PCR的扩增会被细胞的代谢产物抑制的问题,Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit(货号MP0035)的PCR法支原体检测试剂盒说明书中也特别提到了这点,说明这是一个PCR法支原体检测中经常遇到的问题,其强烈建议用试剂盒进行DNA提取后再进行鉴定。这也是PCR法支原体检测的致命弱点。


为了克服该问题,您购买的PCR法支原体检测试剂盒,其扩增产物中必须含有内参(Internal Contol)条带作为对照【本试剂盒的586 bp条带就是内参条带】。否则,如果没有内参作为对照,即使样品扩增后没有支原体特异条带,你也无法确定是因为样品确实没有支原体还是因为PCR被细胞的代谢产物抑制导致的假阴性。


如果出现PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制时,可以采取以下几种措施:


(1) 将取样的时间提前到换液后2天或3天,此时细胞上清的PCR扩增抑制物相对比较少,一般不会产生严重的抑制。


(2) 用水对待测样品直接进行稀释,比如取10 μL上清,加90 μL水,然后取稀释后的样品2 μL进行检测(注:该方法会降低检测的灵敏度)。


(3) 用PBS对待测样品进行离心清洗,去除样品中的抑制物。具体方法如下:取1 mL细胞上清,先13000 rpm离心5 minutes,吸走950 μL上清;加PBS 950 μL,再次离心,吸走950 μL上清;再加PBS 950 μL,第三次离心,吸走全部上清,用50 μL 10 mM Tris-HCl, pH 8.5 重悬沉淀,95 ℃加热处理10 minutes,简单离心后,取上清进行检测。但是该方法有如下缺点:第一,如果样品支原体含量较少,离心清洗可能导致漏检,因为离心清洗过程中,可能导致支原体部分丢失。第二,个别样品,即使经过上述清洗也无法彻底去除抑制剂。


(4) 使用支原体基因组DNA抽提试剂盒(推荐使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》),抽提细胞上清的支原体DNA后再进行PCR鉴定。注:为了预防PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制的问题,也可以考虑将所有待测样品全部进行DNA提取后,再使用本试剂盒进行检测。


(5) 使用本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》或者《发光法支原体检测试剂盒》进行检测,经测试,该两种试剂盒的检测都不会被细胞的代谢产物所抑制。


5、 如发现细胞被支原体污染,本公司提供细胞专用支原体清除和预防试剂。


6、 防DNA污染注意事项:


(1) 强烈建议所有操作全部使用进口滤芯吸头(比如:Axygen滤芯吸头)进行操作,以免试剂被污染。


(2) “PCR体系配制的房间、移液枪”(不要使用细胞培养室的移液枪!)和“PCR产物的电泳房间、移液枪”一定要分开,不能在同一个房间进行,也不能使用相同的移液枪进行操作。


(3) PCR产物是导致假阳性的最主要原因,PCR产物不要在PCR体系配制的房间中打开。


(4) 样品处理的房间和移液枪,如有条件,最好也分开。


(5) 收到的支原体引物和内参,可以分装(比如50微升一支)后保存。


(6) 如果发现阴性对照也出现阳性条带,说明发生DNA污染,必须将PCR所有的试剂、引物和水都换掉。


7、 支原体检测样品可以分成两类:第一类,用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液,由于该条件非常适合支原体生长,培养数天后,支原体密度一般较高,可达107-9/mL,建议直接检测。第二类,低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品,由于这些样品即使有支原体污染,支原体含量一般很少,直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测,往往检测不出来。这些样品建议:(1)使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》,将支原体DNA浓缩提取后再进行检测,大约可以将检测灵敏度继续提高10-100倍。该方法速度快,当天出结果,但是可靠性不如后面的培养法。(2)使用支原体液体培养基(必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基)培养3-7天后,再进行检测。具体方法请参考本公司《发光法支原体检测试剂盒》说明书中最后的注意事项部分。该方法速度较慢,需要3-7天,但是可靠性高。


8、 如何提高本试剂盒检测灵敏度:如果预期待测样品支原体含量较少(比如,低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等),可以采取以下几种措施:(1)通过使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》,将支原体DNA浓缩提取后再进行检测(提取过程还可以把所有可能的PCR抑制剂全部去除),大约可以将检测灵敏度提高10-100倍。(2)通过调整PCR反应体系,可以继续提高检测灵敏度10倍【调整后的PCR反应体系如下:PCR的反应体积为30 μL、10×Taq DNA 聚合酶缓冲液(含Mg2+)为3 μL、2.5 mM dNTP为3 μL、5 Units/μL Taq DNA 聚合酶为0.5 μL、支原体引物和内参的体积为2 μL、提取纯化后的待测样品DNA的体积为20 μL、阳性对照支原体DNA为2 μL、体系剩余部分加水补足到30 μL】。以上两者结合,大约可以使检测灵敏度提高100-1000倍。注意:没有提取纯化的待测样品,不能直接扩大待测样品体积,否则PCR被抑制的可能性将大幅度增加。(3)将PCR的循环数增加到40-50个循环。(4)对支原体进行离心浓缩:取1 mL细胞上清,先13000 rpm(约16000 g)离心5 minutes,吸走全部上清,用50 μL 10 mM Tris-HCl, pH 8.5 重悬沉淀,95 ℃加热处理10 minutes,简单离心后,取上清进行检测。该离心浓缩过程大约可以将检测灵敏度提高20倍。


9、 本说明书主要是利用细胞上清进行支原体污染检测,如果有客户想使用细胞本身而不是细胞培养上清进行支原体污染检测,请联系我们。



 二、各公司《PCR法支原体检测试剂盒》选购注意事项



各公司《PCR法支原体检测试剂盒》选购注意事项


目前,PCR法支原体检测仍然是支原体快速检测领域被客户选购最多的方法。目前,商业化的PCR法支原体检测方法就有好几种,各优缺点分述如下:


 (1)不带内参基因的普通PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有2条引物,不带内参基因。通过30-35轮的普通PCR直接检测。需要通过琼脂糖电泳分析检测结果,整个检测过程耗时3-4小时。缺点:无法区分真阴性样品和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品(二者,支原体特异条带均为阴性)。


 (2)带内参基因的普通PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有2条引物,带内参基因。通过30-35轮的普通PCR直接检测。需要通过琼脂糖电泳分析检测结果,整个检测过程耗时3-4小时。优点:可以区分真阴性样品(内参条带为阳性而支原体特异条带为阴性)和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品(内参条带和支原体特异条带均为阴性)。


 (3)巢式PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有4条引物,一般不带内参基因。第一轮,用2条外引物通过30轮的PCR扩增后;第二轮,取少量第一轮的扩增产物作为模板,用2条内引物再进行30轮的PCR扩增。需要通过琼脂糖电泳分析检测结果,整个检测过程耗时6-8小时。缺点:耗时太久,容易产生假阳性、也无法区分真阴性样品和假阴性样品


 (4)不带内参基因的定量PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有2条引物,不带内参基因。通过40轮的定量PCR检测。无需通过琼脂糖电泳分析检测结果,整个检测过程耗时2-3小时。缺点:如果样品有不经过DNA提取,无法区分真阴性样品和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品(二者,均显示为没有扩增)。当然,该方法可以通过将样品DNA进行提取后(提取过程可以去除所有可能的抑制因素),再进行检测,从而排除可能的假阴性结果出现。


由于PCR法支原体检测过程中,PCR的扩增可能会被细胞的代谢产物抑制的问题,是该方法的致命弱点。Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit(货号MP0035)的PCR法支原体检测试剂盒说明书中也特别提到了这点,说明这是一个PCR法支原体检测中经常遇到的问题,其强烈建议用试剂盒进行DNA提取后再进行鉴定。


 上述4种PCR支原体检测方法中,只有方法(2)可以区分真阴性样品(内参条带为阳性而支原体特异条带为阴性)和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品(内参条带和支原体特异条带均为阴性)。所以,大家选购各公司的PCR法支原体检测试剂盒时,如果不打算进行样品DNA的提取,尽量选取含内参基因的上述方法(2)类的支原体检测试剂盒,比如本公司的《PCR法支原体检测试剂盒》(货号:PM008)和Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit(货号:MP0035)。









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 三、产品价格​​和价格对比


产品名称:《PCR法支原体检测试剂盒》;货号:PM008;价格:1200元/100次;平均每个样品12元。


价格对比:以Sigma公司的​​​LookOut® Mycoplasma PCR Detection Kit(货号MP0035)为例,2014年目录价为3469元/24次检测,每次检测约需145元。国内其他品牌的PCR法支原体检测试剂盒,每次检测也普遍需要30-50元。

 


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