​上海易色医疗科技有限公司

Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.

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    支原体（Mycoplasma）是一种没有细胞壁的原核生物，大小约0.3 - 0.8微米。目前，已发现的支原体品种有100多种。其中，有20种左右曾经在各种细胞培养体系中检测到，但超过98%以上的支原体污染是由6-8种引起的。而且同一种细胞经常被多种支原体污染。

 

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    由于支原体直径较小，经常可以穿过实验室常规的0.20微米孔径的除菌滤膜，高压过滤时，甚至可以穿过0.10微米孔径的除菌滤膜,造成细胞的支原体污染。细胞培养的支原体污染来源主要有：（1）细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最主要原因；（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等。（3）细胞培养用的组分，如血清、培养液等；

    培养的细胞被支原体污染后，几乎可以改变细胞的所有功能，其可以导致细胞染色体的异常和损伤，改变细胞的代谢、生长、形状、附着，影响病毒的扩增能力和产量等等。例如，Miller CJ等人通过Microarray的研究表明：支原体污染严重改变被污染细胞的基因表达谱 [1, 2]，支原体污染后与无污染的同一细胞系相比，表达差异达2倍以上的基因就有200多个！！！（详细数据请见参考文献 1）。Edward Burnett 和 Liz Penn认为：被支原体污染的细胞系已经不是原来的细胞系，而是另外一个细胞系了 [3]！此外，严重的支原体污染将彻底摧毁一株细胞系。

   从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。

    ​总之，在细胞系上进行生物医学方面的科学研究，如果不能保证所用的细胞系无支原体污染（Mycoplasma-free），则所得出的结论是极端不可靠甚至是完全错误的！可以想象：全球范围内，每年因支原体污染导致白白浪费的科研经费的数量是多么的巨大，有人估计至少高达数十亿美金！

   

    

   据Corning公司报道，世界各国的细胞系都有不同程度的支原体污染，可以说支原体污染是细胞培养领域的一个世界性问题 [4]。表1是美国ATCC、FDA、以及其他两家细胞检测机构的支原体污染统计数据。表2是世界各国的细胞系污染比例。目前，世界各国细胞系支原体污染的平均比例为30-60%。

 

    表1，细胞支原体污染统计结果，数据来自参考文献 [4]

                                 

    表2，世界各国的细胞系污染比例，数据来自参考文献 [4]

​细胞库	USA-ATCC	USA-FDA	Germany-DSM	Argentina	Japan-IFO	China
污染率	14%	15%	36%	65%	80%	？

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    由于支原体体积比细菌小很多，通常支原体污染密度非常的高，可达10^7-9/mL培养液，但即使这么高密度的支原体污染也无法通过普通显微镜的肉眼观察进行判断。

    而且，轻度到中度的支原体污染并不会导致细胞形态或生长速度的明显改变，也不会明显改变培养液的浑浊度或培养液的pH值。

    以上两个原因就导致体外培养的细胞即使被支原体污染了，一般的科研工作者也不会觉察到。也就是说：如果不进行支原体的常规检测，你甚至不知道你培养的细胞被支原体污染了，而污染的支原体却在悄悄改变你的实验数据和实验结果，你却被蒙在鼓里！

方法一：培养法。直接将待测样品涂布在支原体液体或固体培养基上，让其生长，一般需要数周，才能看到菌液变浑浊或有菌落长出。 培养法是支原体检测最经典的方法，其优点是：灵敏度适中和结果可靠。但是培养法的一个主要缺点是时间周期太长，不适合作为细胞污染的快速检测方法。

方法二：DNA的荧光染色法。荧光染剂（如Hoechst 33258，DAPI）可以结合到细胞和支原体的DNA。被支原体污染的细胞经染色后，如果在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体的DNA，则证明有支原体之污染。该法相对培养法快速，但是灵敏度较差。当用荧光染色法发现有支原体后，支原体的清除相对就较困难。

方法三：扫描电镜法。将细胞样品进行扫描电镜拍照，如果被支原体污染可以在细胞表面看到密密麻麻的小颗粒。该方法由于要使用电子显微镜，不适合用作实验室常规检测。

方法四：PCR法。PCR法相对较快，灵敏度也较高。是目前实验室最常用的支原体检测方法。但是PCR法也有自己的致命缺点：细胞培养液上清常含有强烈抑制PCR扩增的代谢产物。因为很多研究人员直接使用细胞培养液上清原液进行PCR检测，如果检测为阴性就认为没有支原体污染。其实，还有一种可能性，就是PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制了，而不是没有支原体污染！详细情况，请参见本网站支原体检测页面。

    

    

    由于支原体不含细胞壁，通常使用的抑制细胞壁合成的抗生素（如青霉素等）对其没有效果。本公司开发的支原体清除试剂1和支原体清除试剂2含有专门的支原体特效药物，其中支原体清除试剂1

含有抑制支原体蛋白质合成的药物，而支原体清除试剂2含有抑制支原体DNA合成的药物。由于两种试剂的作用机理不同，支原体清除试剂1需要处理15天，而支原体清除试剂2只需处理7天。两者都可以达到永久杀灭和清除支原体的目的。

  ​5-10%的支原体会对清除试剂1或清除试剂2产生抗性，此外，也有3-5%左右的细胞会在杀灭支原体的过程中死亡，由于上述两个原因，我们一般建议同时购买两种支原体清除试剂，如果发现细胞被污染，可以将细胞分成两份，分别用清除试剂1和清除试剂2同时进行杀灭，这样支原体对两种药物同时产生抗性和处理过程中细胞同时死亡的概率会非常低。

1.     Miller CJ, Kassem HS, Pepper SD, Hey Y, Ward TH, Margison GP. Mycoplasma infection significantly alters microarray gene expression profiles. Biotechniques. 2003 Oct;35(4):812-4.

2.    Aldecoa-Otalora E, Langdon W, Cunningham P, Arno MJ. Unexpected presence of mycoplasma probes on human microarrays. Biotechniques. 2009 Dec;47(6):1013-5.

3.     Edward Burnett and Liz Penn, European Collection of Cell Culture (ECACC®). Mycoplasma Detection and Elimination. Don Finley, Market Segment Manager, Sigma® Life Science. Biofiles, Vol. 8, No. 18

4.     John Ryan (2008). "Understanding and Managing Cell Culture Contamination". Corning Incorporated. p. 24.

《支原体清除和预防试剂》使用说明书（版本20201215）

【PDF版说明书，请到本网站 下载中心 页面下载！】

货号

      MR002            支原体清除试剂1

      MR003            支原体清除试剂2

运输和储存

      该产品在常温下运输，收到产品后请放于-20 ℃保存，该条件下，至少可以保存2年。

产品用途

      该产品专用于杀灭和清除哺乳动物细胞培养液中污染的支原体。该产品仅用于基础研究，非临床用品。

试剂盒组成

        支原体清除试剂1              1.0 mL (清除：按1:1000加入；预防：按1:5000加入)

支原体清除试剂2              1.0 mL (清除：按1:1000加入；预防：按1:5000加入)

支原体简介

     支原体（Mycoplasma）是一种没有细胞壁的原核生物，大小约0.3 - 0.8微米。目前，已发现的支原体品种有100多种。 由于支原体直径较小，经常可以穿过实验室常规的0.20微米孔径的除菌滤膜，高压过滤时，甚至可以穿过0.10微米孔径的除菌滤膜，造成细胞的支原体污染。

     细胞培养的支原体污染来源主要有：（1）细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最主要原因；（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等。（3）细胞培养用的组分，如血清、培养液等；

哺乳动物细胞的培养，支原体污染是个世界性的问题。目前，世界各国细胞系支原体污染的平均比例为30-60%，有些国家甚至高达80-90%。

     支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误（支原体污染对细胞的详细危害，请参考本公司的网站：www.yisemed.com）。

     从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测，以保证所用的细胞没有支原体污染。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。

    由于支原体体积比细菌小很多，通常支原体污染密度非常的高，可达10^7-9/mL培养液，但即使这么高密度的支原体污染也无法通过普通显微镜的肉眼观察进行判断。而且，轻度到中度的支原体污染通常不会导致细胞形态或生长速度的明显改变，也不会明显改变培养液的浑浊度或培养液的pH值。

   以上两个原因就导致体外培养的细胞即使被支原体污染了，一般的科研工作者也不会觉察到。也就是说：如果不进行支原体的常规检测，你甚至不知道你培养的细胞被支原体污染了，而污染的支原体却在悄悄改变你的实验数据和实验结果，你却被蒙在鼓里！

   发现培养的细胞被支原体污染，将污染的细胞高压蒸汽灭菌，然后丢弃是最好的选择，这样可以避免细胞的交叉污染。但是如果细胞比较珍贵，可以考虑用支原体清除试剂进行杀灭和清除。

产品简介

   本公司开发的支原体清除试剂1含有抑制支原体蛋白质合成的药物，而支原体清除试剂2含有抑制支原体DNA合成的药物。由于两种试剂的作用机理不同，支原体清除试剂1需要处理不少于15天，而支原体清除试剂2只需处理7天。两者都可以达到永久杀灭和清除支原体的目的。

    大约5-10%的支原体会对清除试剂1或清除试剂2产生抗性，此外，也有3-5%左右的细胞会在杀灭支原体的过程中死亡，由于上述两个原因，我们一般建议同时购买两种支原体清除试剂。如果发现细胞被污染，可以将细胞分成三份：第一份添加清除试剂1，第二份添加清除试剂2，第三份同时添加清除试剂1和清除试剂2进行杀灭，这样支原体对两种药物同时产生抗性和处理过程中细胞同时死亡的概率会非常低。

使用方法

（一）支原体清除试剂1

1. 使用之前，先将支原体清除试剂1用PBS或者无血清培养液稀释10倍后，放4℃冰箱保存。

2. 将50-100万个细胞铺到60 mm的细胞培养皿内，加入4 mL含支原体清除试剂1的正常细胞培养液（使用稀释10倍后的支原体清除试剂1，按1:100比例加入）。

3.每2-3天更换细胞培养液。换液时，用PBS冲洗2-3遍细胞，以将死亡的支原体清洗干净。而后加入新鲜的含支原体清除试剂1的正常细胞培养液。期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要胰酶消化），并更换新的培养皿。

4. 处理15天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全。如果仍有支原体残留，可以考虑再处理6天。

5. 以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。

（二）支原体清除试剂2

1. 使用之前，先将支原体清除试剂2（注意：支原体清除试剂2在-20 ℃保存后，解冻时可能会有细小的结晶析出）用PBS或者无血清培养液稀释10倍后（此时，支原体清除试剂2应该彻底溶解），放4℃冰箱保存。

2. 将50-100万个细胞铺到60 mm的细胞培养皿内，加入4 mL含支原体清除试剂2的正常细胞培养液（使用稀释10倍后的支原体清除试剂2，按1:100比例加入）。

3.每1-2天更换细胞培养液。换液时，用PBS冲洗2-3遍细胞，以将死亡的支原体清洗干净。而后加入新鲜的含支原体清除试剂2的正常细胞培养液。期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要胰酶消化），并更换新的培养皿。

4. 处理7天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全。如果仍有支原体残留，可以考虑再处理3天。

5. 以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。

注意事项

 建议将细胞分成三份：第一份添加清除试剂1，第二份添加清除试剂2，第三份同时添加清除试剂1和清除试剂2进行杀灭（注：同时添加两种药物可能对细胞的毒性较大，但是杀灭的概率会非常高），这样支原体对两种药物同时产生抗性和处理过程中细胞同时死亡的概率会非常低。如果同时添加清除试剂1和清除试剂2，细胞可以每2天更换一次培养液。

 处理过程中，注意每天观察细胞的状况，如果发现支原体清除试剂对细胞的毒性较大，可以加大培养液中的血清浓度或者提高细胞的密度。

 清除试剂1和清除试剂2在降低浓度后（使用稀释10倍后的支原体清除试剂1或者2，按1:500比例加入）也可以加入到培养液中作为短期（1-2个月）的支原体污染预防药物，但是不建议在细胞培养液中长期（超过2个月）加入，因为有可能导致对该两种药物有抗性的支原体出现。

        

        如上图所示，左侧为未经支原体清除试剂处理的人Hela细胞,经DAPI染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被染成蓝色，这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA。而右侧为经过本公司的支原体清除试剂2处理7天的Hela细胞，经DAPI染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质没有任何絮状核酸物质被染成蓝色，说明支原体已经被清除。

        鉴于DAPI染色法的灵敏度较低，支原体是否被彻底清除还需要用更灵敏的方法进一步检测确认，如使用本公司的四款快速《支原体检测试剂盒》进行确认。

        盗图必究！

1.       细胞生物学：支原体污染将直接导致最常用的MTT细胞毒性实验结果的严重错误！

 

l  结果：由于支原体对MTT的额外还原作用，对阿霉素（Doxorubicin, 一种抗肿瘤药物）的抗性，支原体污染和非污染的细胞二者相差15倍！（Due to an additional reduction of tetrazolium by mycoplasmas, contaminated cells appeared up to 15 fold resistant to doxorubicin.）

l  参考文献：Falsification of tetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assay results due to mycoplasma contamination of cell cultures. Anticancer Res. 1999 Mar-Apr; 19(2A):1245-8.

 

2.       免疫学：支原体污染本身将可以直接诱导树突状细胞的成熟！这对于目前国内外普遍开展的人体免疫细胞的肿瘤治疗将是灾难性的。

 

l  结果：（1）The capacity of these cell lines to induce DC maturation was due to their contamination by mycoplasma. Our results reveal that DC are able to sense mycoplasma infection and mature as they do in response to most viruses and bacteria. （2）Further investigation demonstrated that the changes in DC phenotype and functions were due to the presence of mycoplasmas in these two cell lines; eradication of mycoplasmas completely abolished the observed effects, and importantly, pure mycoplasmas in the absence of tumor cell supernatants were able to produce the same effects.

l  参考文献：（1）Dendritic cell maturation is induced by mycoplasma infection but not by necrotic cells. Eur. J. Immunol. 2000. 30: 705–708。（2）Mycoplasma-mediated alterations of in vitro generation and functions of human dendritic cells. J Biomed Sci. 2005;12(1):31-46.

 

3.       神经生物学：支原体污染本身可以直接降解淀粉样多肽Amyloid-beta (Abeta)！

 

l  结果：These data show that mycoplasmas degrade Abeta and thus may represent a significant source of variability when comparing extracellular Abeta levels in different cell lines.

l  参考文献：（1）Amyloid-beta peptide degradation in cell cultures by mycoplasma contaminants. BMC Res Notes. 2008 Jun 30;1:38. （2）Neuroprotective effects of Mycoplasma hyorhinis against amyloid-β-peptide toxicity in SH-SY5Y human neuroblastoma cells are mediated by calpastatin upregulation in the mycoplasma-infected cells. Neurochem Int. 2011 Mar;58(4):497-503.

 

4.       生物化学：支原体污染可以直接影响L-arginine的代谢！

 

l  结果：This demonstrates that infection with M. hyorhinis leads to different effects on gene regulation of the murine and human iNOS gene. Our study underlines the importance of routine checking of cell cultures for mycoplasma contamination, particularly in studies on NO-mediated effects or inflammatory processes.

l  参考文献: Impact of Mycoplasma hyorhinis infection on L-arginine metabolism: differential regulation of the human and murine iNOS gene. Biol Chem. 2005 Oct;386(10):1055-63.

 

5.       病理学：支原体污染可以直接刺激前列腺素E2（Prostaglandin E2）的产生！

 

l  结果：Mycoplasma fermentans (MF) also stimulated PGE(2) production. The co-infection of mycoplasma and Chlamydia resulted in an additive effect in the production of PGE(2). Thus it is important to use host cells and Chlamydia free of mycoplasma contamination for the analysis of Chlamydia-induced prostaglandin production.

l  参考文献:Production of prostaglandin E2 in monocytes stimulated in vitro by Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, and Mycoplasma fermentans. Microb Pathog. 2004 Sep;37(3):155-61.

 

产品名称：《支原体清除1》；包装规格：1.0 mL（1000x）；货号：MR002；价格：580元。​

产品名称：《支原体清除2》；包装规格：1.0 mL（1000x）；货号：MR003；价格：580元。​