​上海易色医疗科技有限公司

Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.

一、《探针法支原体检测试剂盒》产品重要信息

（1）产品价格：《探针法支原体检测试剂盒》（货号：QM016）；价格：1300元/50次（平均每个样品26元）。

（2）产品说明书： PDF版说明书，请到本公司网站“下载中心”页面下载！

（3）方法学报告： 《探针法支原体检测试剂盒》方法学报告，请到本公司网站“下载中心”页面下载！

二、《探针法支原体检测试剂盒》（含内参）说明书（版本20230715）

 

【本说明书会不定期更新，每次收到新的产品时，请到本公司网站重新下载最新版本！】

 

货号

QM016

包装规格

50次/盒

储存条件

该产品在常温或随冰袋运输，收到产品后，请立即放-20 ℃冰箱低温避光保存。该条件下，至少5年内有效。

产品用途                                                                                            

《探针法支原体检测试剂盒》（qPCR Mycoplasma Detection Kit with Probe）采用支原体特异性引物和支原体特异性荧光探针（报告基因为FAM），用于对样品的支原体基因组DNA进行荧光定量PCR扩增检测。

试剂盒内同时含有内参对照质粒mycoIC2和相应的引物和荧光探针（报告基因为VIC），用于监控支原体DNA提取和qPCR扩增的效率。

本试剂盒可用于检测一切可能含支原体的样品，比如：（1）体外细胞培养的上清；（2）血清；（3）各种体液，如唾液、尿液、鼻腔分泌物等；（4）别的液体样品。本产品仅供研究使用。

产品简介

哺乳动物细胞的培养，支原体（Mycoplasma）污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误（支原体污染对细胞的详细危害，请参考本公司的网站：www.yisemed.com）。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。

培养法是相对可靠的支原体检测技术，但是该方法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外，通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20-50%。

有的实验室使用荧光染色法检测支原体，但是该方法灵敏度太低，当检测成阳性时，细胞经常已经严重污染。

培养法和荧光染色法虽然是我国药典收录的支原体检测方法，但是因为其各自都有明显的缺点，不适合作为支原体快速检测的方法。

本公司目前已经开发出四种不同原理的快速支原体检测试剂盒，分别是：《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》，其各自都有自己的优缺点（详情请参考本公司网站）。

《探针法支原体检测试剂盒》具有100%支原体识别率、最高的检测灵敏度、最高的检测正确率、含内参对照从而可以区分真阴性样品和假阴性样品等一系列优点，该方法被认为是支原体快速检测的金标准。如果您实验室已经拥有（或者打算购买）荧光定量PCR仪，我们强烈推荐您选择《探针法支原体检测试剂盒》。

《探针法支原体检测试剂盒》主要缺点：方法本身没有明显缺点，配套仪器相对昂贵。

经测试，本公司开发的《探针法支原体检测试剂盒》至少可以识别在体外细胞培养中曾经报道出现的20种支原体，根据文献报道，这些支原体基本上占污染细胞的支原体种类的100%。具体如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、(11) M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、 (14) M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（注：M.为Mycoplasma的缩写；A.为Acholeplasma的缩写）。根据支原体DNA的序列，本试剂盒可以识别100多种至今已发现的支原体，具有广谱的识别能力。如果客户发现除上述20种支原体外，还有其他的支原体也会污染体外培养的细胞，或者客户纯粹就是想检测其他的支原体，请告诉我们支原体的名称，我们将进行序列比对，然后告诉你本试剂是否可以识别。

《探针法支原体检测试剂盒》检测灵敏度：经测试，在每个反应管的DNA加入量为2μL的情况下，本试剂盒的最高检测灵敏度（即检测下限）大约在4-16 copies，即2-8 copies/μL。可以通过离心浓缩、提取支原体基因组DNA、增加每个反应管中的DNA加入量等措施，其检测灵敏度可以在此基础上继续提高10-1000倍。

此外，作为支原体检测领域的共识，单独使用任何一种支原体检测方法，都无法做到100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。严格的支原体检测，至少需要使用两种（最好使用三种）不同原理的支原体检测方法同时进行检测，才能使检测结果接近100%正确。

如果您想得到100%正确的支原体检测结果（比如，开展细胞治疗的客户，进行干细胞培养的客户，生产血清、胰酶、培养液的客户，出售各种原代培养细胞系和肿瘤细胞系的客户等），任选本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》中的两种进行检测，将会得到比较满意的结果。如果几种不同支原体检测方法的检测结果一致，正确率几乎就是100%。

试剂盒组成

（1）       探针法溶液1P：550 μL（50次），含支原体和内参检测用引物及荧光探针;

（2）       探针法溶液2T：50 μL（50次），酶溶液;

（3）       内参质粒mycoIC2：500 μL;

（4）       去离子水：1.2 mL；

（5）       阳性支原体DNA：50 μL。

l注1: 本试剂盒由于含有内参质粒mycoIC2（用于监控支原体DNA提取和qPCR扩增的有效性），客户可以选择进行样品支原体DNA的提取（内参质粒mycoIC2在支原体DNA提取过程中加入），也可以选择不进行样品支原体DNA的提取（内参质粒mycoIC2在配制体系时加入）。

l注2：客户如果选择进行样品支原体DNA的提取，推荐使用本公司的《支原体基因组DNA提取试剂盒》（货号： MG015）。该试剂盒的操作方法和试剂配方根据支原体的特点做了专门的优化和调整，其洗脱液与本公司的所有基于核酸扩增技术的支原体检测试剂盒完全兼容【包括：《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》】。如果是其他公司DNA提取试剂盒的洗脱液，当反应体系中DNA量加大后（比如反应体系中DNA加入量由2 μL变为20 μL时）有可能会影响到核酸的PCR扩增效率。

l注3：本试剂盒的配套仪器可以是任何具有FAM和VIC检测通道的荧光定量PCR仪。需自备的试剂和耗材：荧光定量PCR八联管、一次性手套、无DNAase的吸头、无DNAase的离心管。

检测过程

 1.待测样品的前处理

为了准确判断细胞是否有支原体的污染，待测的细胞培养液样品需要取自换液后培养2-3天且汇合度在90%左右的细胞培养液上清（贴壁细胞）。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后，让细胞生长2-3天再取培养液进行检测。可以按照以下两种方法之一进行样品的前处理：

1.1 方法一：对样品进行支原体DNA的提取。

很多样品（比如：培养很多天的细胞上清、血清、血浆等）由于含有抑制PCR扩增的成分，如果样品不进行前处理而直接检测，有可能导致qPCR扩增失败（qPCR结果：支原体通道和内参对照通道均无扩增曲线）。该类样品建议客户进行样品DNA提取（或者离心清洗，见后文方法二）后，再进行检测。提取DNA的过程有两个作用：（1）基本可以去除所有抑制PCR扩增的成分，保证后续定量PCR扩增的正常进行；（2）具有浓缩支原体DNA的作用，可以提高相对检测灵敏度10-100倍。

样品DNA的提取推荐使用本公司的《支原体基因组DNA提取试剂盒》（货号： MG015）。不同样品支原体基因组DNA的提取步骤，请参考本公司的《支原体基因组DNA提取试剂盒》的说明书。

1.2 方法二：样品不经DNA提取（推荐方法。该方法不仅可以浓缩支原体从而提高相对检测灵敏度，还可以去除绝大部分可能的抑制物，PCR扩增被抑制的可能性极低。如果该简单一步离心清洗的方法仍然无法去除抑制物，可以使用后文注意事项部分的三步离心清洗的方法。），具体方法如下：

（1）根据浓缩倍数，可以取100 - 1500 μL上述待测样品到1.5 mL离心管内，在普通台式离心机上1000 rpm (大约150 g)低速离心5 minutes，将离心后的上清转移到另一个离心管内，丢弃细胞沉淀。

（2）将上清继续13000 rpm（约16000 g）高速离心10 minutes，小心吸走全部上清（为避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液体），用50μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（样品可以长期保存。推荐）或者去离子水（样品比较不稳定，只适合当天或短期内检测使用）重悬沉淀（沉淀中含有支原体），吹吸均匀【如果最初使用了1500 μL的样品，则支原体浓度大约提高了30倍】。

（3）至此，该样品可以直接进行检测，也可以进行热处理后再检测（热处理后，样品保存更稳定）。热处理具体如下：95 ℃加热处理5 minutes（可以转移到PCR管内，在PCR仪上进行加热处理），简单离心（1000 g，5 seconds）后，取上清进行检测。

 l注1：这里的细胞培养上清不是指细胞经胰酶消化后的离心上清，而是指至少培养2天后的贴壁细胞培养液上清（不需要胰酶消化，也不能取经胰酶消化后的离心上清进行检测）或悬浮细胞培养液。

 l注2：本步骤的低速离心是为了去除哺乳动物细胞，以排除其不必要的干扰。所以离心力要严格控制在150-200 g，该离心力下，哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会。如果错误使用更高的离心力将可能导致支原体也被离心下来，从而导致假阴性。

 l注3：收集的待测细胞培养液样品如果不立即检测，请放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月，在-80℃可以长期保存。此外，为了节约检测成本，可以将不同时间收集的样品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起检测。

2. 荧光定量PCR体系的配制【本步骤所有操作强烈建议使用进口滤芯吸头（比如Axygen滤芯吸头）进行操作，以避免试剂被污染。操作之前，请认真看完后文的注意事项后，再进行操作】：

将探针法溶液1P、阳性支原体DNA、去离子水、内参质粒mycoIC2从-20 ℃冰箱中取出，放室温融化（也可以用手握住帮助融化）。探针法溶液1P和探针法溶液2T开盖之前，请高速离心一下（5000 rpm，离心1分钟）。探针法溶液2T不能在室温长久放置（可以短时间放置5-10分钟），建议在-20 ℃冰箱直接吸取。

如果样品总数为N（N=待测样品数+1个阳性对照+1个阴性对照），待测样品的前处理方法不同，对应的反应体系也不同，具体如下：

2.1样品经《支原体基因组DNA提取试剂盒》进行DNA提取后的反应体系（注意：在DNA提取过程中，必须按说明书加入内参质粒mycoIC2。如果提取时没有加入内参质粒mycoIC2，则按照后文“样品不经DNA提取的反应体系”进行操作）：

（1） 反应体系：

表1. 样品经DNA提取后的反应体系

	单个样品体积(μL)	样品总数	总体积(μL)
探针法溶液1P	11	N	11×N×1.06
探针法溶液2T	1	N	1×N×1.06

l注：总体积中多配制6%（该比例客户如果觉得不合适，可以自己调整），是为了防止移液误差，以保证每个反应管中的反应液足量。

l举例：如果待测样品为8个（加上1个阴性和1个阳性对照），则样品总数为10个。探针法溶液1P的总体积为11×10×1.06=116.6 μL，探针法溶液2T的总体积为1×10×1.06=10.6 μL。

（2） 将上述2种溶液混合，吹打均匀后，按每管12  μL分装到荧光定量PCR八联管中。

（3） 待测样品管加入18 μL提取好的待测样品DNA（样品DNA加入量不能减少，否则内参质粒扩增可能失败）；阴性对照管加入2 μL内参质粒mycoIC2（吹吸均匀后加入）和16 μL去离子水（为防止去离子水被污染，此处建议使用20 μL移液枪配合200 μL吸头进行吸取操作）；阳性对照管加入2 μL阳性支原体DNA（吹吸均匀后加入）和16 μL去离子水。每管反应液的总体积为30 μL。

2.2 样品不经DNA提取的反应体系：

（1） 反应体系：

表3. 内参质粒mycoIC2统一在配制PCR反应体系时加入

	单个样品体积(μL)	样品总数	总体积(μL)
去离子水	14	N	14×N×1.06
探针法溶液1P	11	N	11×N×1.06
探针法溶液2T	1	N	1×N×1.06
内参质粒mycoIC2	2	N	2×N×1.06

l注：总体积中多配制6%（该比例客户如果觉得不合适，可以自己调整），是为了防止移液误差，以保证每个反应管中的反应液足量。

l举例：如果待测样品为8个（加上1个阴性和1个阳性对照），则样品总数为10个。去离子水的总体积为14×10×1.06=148.4 μL，探针法溶液1P的总体积为11×10×1.06=116.6 μL，探针法溶液2T的总体积为1×10×1.06=10.6 μL，内参质粒mycoIC2的总体积为2×10×1.06=21.2 μL。 

（2） 将上述3种溶液混合，吹打均匀后，按每管28  μL分装到荧光定量PCR八联管中。

（3） 待测样品管加入2 μL待测样品DNA，阴性对照管加入2 μL去离子水，阳性对照管加入2 μL阳性支原体DNA（吹吸均匀后加入）。每管反应液的总体积为30 μL。

（4）盖上荧光定量PCR八联管盖子，去除反应管中的大气泡，3000-6000 rpm离心30 sec。

l注：定量PCR八联管的封盖，应该佩戴全新的PE手套进行操作，避免裸手接触定量PCR八联管。

3. 实时荧光定量PCR扩增：

将PCR八联管放入荧光定量PCR仪内，设置如下实时荧光定量PCR扩增程序：

表3. 荧光定量PCR扩增程序

步骤	作用	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	预变性	1 cycle	95 ℃	2 min	否（No）
2	预扩增 （不收集荧光）	5 cycles	95 ℃	10 sec	否（No）
			60 ℃	35 sec	否（No）
3	正式扩增 （需要收集荧光）	40 cycles	95 ℃	10 sec	否（No）
			60 ℃	35 sec	是（Yes）

l 注：支原体检测荧光通道选择FAM（Reporter: FAM，Quencher: None）；内参对照检测荧光通道选择VIC（Reporter: VIC, Quencher: None）；反应体积（Sample Volume）为30 μL；参考荧光（Passive Reference，只有ABI仪器需要设置）选择None。

4.   结果分析：

4.1 ABI StepOne Plus 荧光定量PCR仪基线和阈值设定方法（注：其他荧光定量PCR仪的设置大同小异，请参考各自仪器说明书进行设置）：

（1）基线（Baseline）的设定：可以将Auto baseline前面的√ 去掉，然后手动设置基线的起点为2（将刚开始荧光值不稳定的几个循环排除在基线之外。如果起点2不合适，可以适当增减），终点为10左右。

（2）阈值（Threshold）线的设定：不同通道的阈值应该分别设定。设定某个通道阈值线时，首先选中含阴性对照的若干个样品，去掉仪器勾选的自动Threshold线，将其选项“√ Auto”改为“  Auto”，然后手动调整阈值线，以阈值线刚好超过正常阴性对照FAM通道扩增曲线（无规则噪音线）的最高点为准。

4.2 实验有效性判断：

阳性对照管：其FAM通道有典型的S型扩增曲线（即指数扩增），其VIC通道的扩增线呈直线或者S型曲线。

阴性对照管：其FAM通道的扩增线呈直线，其VIC通道应该有典型的S型扩增曲线。

如果阳性对照管、阴性对照管同时满足上述条件，则说明本次实验结果有效，否则实验结果无效。

典型的阴性直线型扩增线和阳性S型扩增曲线如图1所示：

组合       FAM通道（测支原体）    VIC通道（测内参）       支原体污染判断

1                            S型曲线                                           S型曲线                    支原体污染

2                           S型曲线                                              直线                          支原体污染

3                              直线                                           S型曲线                           无支原体

4                              直线                                               直线                      PCR被抑制，结果无效

待测样品管只要FAM通道有S型扩增曲线（组合1和组合2）就说明有支原体污染。因为外加的内参质粒mycoIC2分子数极少，如果支原体含量很大时，内参质粒的扩增会被彻底抑制，导致内参VIC通道无信号（组合2）。

如果待测样品管FAM通道呈直线，而VIC通道有S型曲线（说明：样品的DNA提取过程和PCR扩增过程均正常）（注：由于提取过程中，外加的内参质粒mycoIC2分子数极少，作为内参对照的VIC通道的Ct值会比较大），说明样品无支原体。

如果阳性对照管和阴性对照管结果正常，而待测样品管FAM通道和VIC通道均呈直线，说明PCR被抑制。如果样品是经过提取的，最可能原因是：DNA洗脱前，吸附膜中的乙醇没有挥发彻底（解决方法：洗脱前，将吸附柱放50-65℃烘箱至少15分钟）。如果样品是没有经过提取的，则样品本身含有抑制PCR的成分（解决方法：将样品进行DNA提取或者离心清洗）。此外，二者相同的可能原因有（此种情况发生概率很低，一般不需要考虑）：内参质粒mycoIC2在运输和储存中有部分降解，导致回收或者加入的内参质粒mycoIC2分子偏少，导致内参VIC通道扩增失败（解决方法：将内参质粒mycoIC2的加入量增加到原来的2-4倍）。

 注1：阳性结果需要结合扩增曲线（主要）和Ct值（次要）进行判断，不能只看Ct值（因荧光值的波动，个别阴性样品虽然扩增曲线基本呈直线，但可能会出现Ct值，此类样品不能判断为阳性。反之亦然：有些样品有S型曲线，但是因为荧光值波动，导致没有Ct值，此类样品不能判断为阴性）。

 注2： 结果判断完后，将PCR八联管用自封袋密闭后，进行适当处理。

注意事项

1. 实验全过程，应该佩戴一次性手套操作。

2. 防DNA污染注意事项：

（1）强烈建议所有操作（特别是qPCR体系配制步骤和吸取试剂盒中试剂的时候）使用进口滤芯吸头（比如：Axygen滤芯吸头）进行操作，以免试剂被污染。如果没有滤芯吸头，至少应该使用新开封的吸头。

（2）必须确保使用的移液枪本身没有残留的支原体。因此，最好使用全新购买的移液枪。如果没有新购买的移液枪，至少应该使用以前没有进行过细胞操作的移液枪。因为进行过细胞培养的移液枪极有可能被含支原体的培养液污染（如细胞培养时，不小心将含支原体污染的培养液吸入移液枪的枪体内）。由于本试剂盒非常灵敏，移液枪中吸附的支原体有可能造成不必要的假阳性。

（3）样品前处理的各类吸头、离心管，以及吸取阳性对照DNA、待测样品DNA的吸头，务必小心处理，请将其装入含有半瓶水的带盖的、可密封的瓶子内，全部样品吸取完后，盖上瓶盖，以防止阳性DNA的挥发，造成环境的污染，进而造成假阳性。

（4）整个操作过程，最好不要说话，因为人的口腔和唾液都是带支原体的。

（5）反应后，请勿打开反应管的盖子，否则有可能造成检测环境的污染。结果判断完后，将其用自封袋密闭后，进行适当处理。

3. 实验室必须严格分房间操作（本试剂盒建议在有窗户、通风良好的普通房间内操作，请勿在密闭的房间操作。请勿在细胞培养间进行该步骤的操作，因为细胞培养间支原体污染概率很高）：

 试剂配制房间1：专门进行定量PCR体系的配制（建议该房间全部使用进口滤芯吸头。）

 DNA提取房间2：专门进行支原体DNA的提取；

 DNA加样房间3：专门进行定量PCR体系配制后，添加待测样品、阳性对照、阴性对照等操作；

 PCR扩增房间4：进行实时荧光PCR扩增检测。

注：如果房间紧张，可以考虑将房间2、房间3合并在一个房间，而房间1和房间4必须独立。各房间物品（包括移液枪）均为专用，不得交叉使用。

4. 如果出现qPCR的扩增被细胞的代谢产物抑制时（qPCR结果：支原体通道和内参对照通道均无扩增曲线），可以采取以下几种措施：

1) 将取样的时间提前到换液后2天或3天，此时细胞上清的PCR扩增抑制物相对比较少，一般不会产生严重的抑制。据我们测试，换液后5天，PCR扩增抑制物就已经大量积累。

2) 用PBS对待测样品进行离心清洗，去除样品中的抑制物。具体方法如下：取1 mL细胞上清，先13000 rpm离心5 minutes，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次离心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次离心，小心吸走全部上清（为避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液体），用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重悬沉淀，95 ℃加热处理5 minutes，简单离心（1000 g，5 seconds）后，取上清进行检测。但是该方法有如下缺点：第一，如果样品支原体含量较少，离心清洗可能导致漏检，因为离心清洗过程中，可能导致支原体部分丢失。第二，个别样品，即使经过上述清洗也无法彻底去除抑制剂。

3) 使用支原体基因组DNA抽提试剂盒（推荐使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》），抽提细胞上清的支原体DNA后再进行PCR鉴定。

4) 使用本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》或者《发光法支原体检测试剂盒》进行检测，经测试，未发现这两种试剂盒会被细胞的代谢产物所抑制。

为了预防PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制的问题，也可以考虑将所有待测样品全部进行离心清洗或者DNA提取后，再使用本试剂盒进行检测。

5. 支原体检测样品可以分成两类：第一类，用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液，由于该条件非常适合支原体生长，培养数天后，支原体密度一般较高，可达107-9/mL，可以直接检测。第二类，低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品，由于这些样品即使有支原体污染，支原体含量一般很少，直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测，往往检测不出来。这些样品建议：（1）对样品的支原体进行离心浓缩或者使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》将支原体DNA浓缩提取，该两种方法大约可以将检测灵敏度继续提高10-100倍。该方法速度快，当天出结果，但是可靠性不如后面的培养法。（2）使用支原体液体培养基（必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基）培养3-7天后，再进行检测。具体方法请参考本公司《发光法支原体检测试剂盒》说明书中最后的注意事项部分。该方法速度较慢，需要3-7天，但是可靠性高。

6. 如何提高本试剂盒检测灵敏度：如果预期待测样品支原体含量较少（比如，低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等），可以采取以下几种措施：（1）通过使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》，将支原体DNA浓缩提取后再进行检测（提取过程还可以把所有可能的PCR抑制剂全部去除），大约可以将检测灵敏度提高10-100倍。（2）对支原体进行离心浓缩：取1 mL细胞上清，先13000 rpm（约16000 g）离心5 minutes，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重悬沉淀，95 ℃加热处理5 minutes，简单离心后（1000 g，5 seconds），取上清进行检测。该离心浓缩过程大约可以将检测灵敏度提高20倍。（3）如果样品是未经提取的，可以通过增加反应管中样品DNA的加入量，比如由原来的2 μL增加到18 μL，如此可以提高检测灵敏度9倍【注意：（A）没有提取纯化或者离心清洗的待测样品，不能直接扩大待测样品体积，否则PCR被抑制的可能性将大幅度增加；（B）如果确定要增加每个反应管中样品DNA的加入量，样品中内参质粒的加入量要成比例减少。比如原来样品DNA的加入量为2 μL ，则50 μL样品中需要加入4 μL内参质粒；如果改变后样品DNA的加入量为16 μL（原来8倍），则50 μL样品中只需加入0.5 μL内参质粒（原来1/8），以保持每个反应管中内参质粒的总加入分子数不变】。

7. 如发现细胞被支原体污染，本公司提供细胞专用支原体清除和预防试剂，以及水浴专用杀菌剂和环境专用杀菌剂。

8. 本试剂盒与Sigma公司的Lookout Mycoplasma qPCR Detection Kit（货号：MP0040A）原理一样，可以替代后者用于细胞培养上清的支原体检测。

三、《探针法支原体检测试剂盒》灵敏度测试

我们选取了上述20种支原体中比较有代表性的4种支原体（分别是：A. laidlawii，M. pneumoniae，M. fermentans和M. orale），使用含相应支原体基因片段的质粒载体，经DNA定量后，计算出相应的分子数。

质粒经10倍系列稀释【从10^(-4)到10^(-11)】后，进行相应的qPCR扩增（每个稀释度做2个重复），其结果如下表所示：

​    说明：各支原体质粒10倍系列稀释的Ct值。每个稀释度做2个重复，每个反应管的DNA加入量为2μL。由表1可知：在每个反应管的DNA加入量为2μL的情况下，《探针法支原体检测试剂盒》对4种支原体的最高检测灵敏度（即检测下限）大约在4-16 copies，即2-8 copies/μL【具体请参考表1中，4种支原体质粒的10^(-10)稀释度的数据】。

    注：《探针法支原体检测试剂盒》检测灵敏度详细数据，请参考其方法学报告。

四、本公司《探针法支原体检测试剂盒》与中国药典收录的支原体液体培养法的灵敏度比较文章：

（点击此处下载文章全文！或者见本网站“下载中心”页面的《探针法支原体检测试剂盒》方法学报告！）

重要结论：影响液体培养法和qPCR法相对灵敏度的主要因素是各自体系中不同的样品加入体积和样品中存活支原体的比例，而由于前一因素导致的两种方法灵敏度的差异，可以通过高速离心浓缩的方法缩小，使两种方法的相对灵敏度基本相同。