上海易色医疗科技有限公司
Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.
《探针法支原体检测试剂盒》产品重要信息
(1)产品价格:《探针法支原体检测试剂盒》(货号:QM016);价格:1500元/50次(平均每个样品30元)。
(2)产品说明书: PDF版说明书,请到本公司网站“下载中心”页面下载!
(3)方法学报告: 《探针法支原体检测试剂盒》方法学报告,请到本公司网站“下载中心”页面下载!
《探针法支原体检测试剂盒》(含内参)说明书(版本20210203c)
本试剂盒可用于检测一切可能含支原体的样品,比如:(1)体外细胞培养的上清;(2)血清;(3)各种体液,如唾液、尿液、鼻腔分泌物等;(4)别的液体样品。本产品仅供研究使用。
如果您想得到100%正确的支原体检测结果(比如,开展细胞治疗的客户,进行干细胞培养的客户,生产血清、胰酶、培养液的客户,出售各种原代培养细胞系和肿瘤细胞系的客户等),任选本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》中的两种进行检测,将会得到比较满意的结果。如果几种不同支原体检测方法的检测结果一致,正确率几乎就是100%。
注3:本试剂盒的配套仪器可以是任何具有FAM和VIC检测通道的荧光定量PCR仪。需自备的试剂和耗材:荧光定量PCR八联管、一次性手套、无DNAase的吸头、无DNAase的离心管。
注3:收集的待测细胞培养液样品如果不立即检测,请放于-20℃或-80℃冰箱保存,不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月,在-80℃可以长期保存。此外,为了节约检测成本,可以将不同时间收集的样品放于-20℃或-80℃冰箱保存,而后一起检测。
如果样品总数为N(N=待测样品数+1个阳性对照+1个阴性对照),qPCR反应体系分为样品经DNA提取和不经DNA提取两个不同反应体系,具体如下:
表1. 样品经DNA提取后的反应体系
单个样品体积(μL) 样品总数 总体积(μL)探针法溶液1P 11 N 11×N×1.1探针法溶液2T 1 N 1×N×1.1
注:装有阳性支原体DNA的螺口管请不要高速离心,开盖之前,只要用手指捏住,用力甩一下即可。吸取之前,请吹吸均匀后再吸取。如果不小心高速离心了,务必吹吸均匀后再吸取,否则阳性对照结果可能异常。
表2. 样品不经DNA提取的反应体系
探针法溶液2T 1 N 1×N×1.06
注:装有阳性支原体DNA的螺口管请不要高速离心,开盖之前,只要用手指捏住,用力甩一下即可。吸取之前,请吹吸均匀后再吸取。如果不小心高速离心了,务必吹吸均匀后再吸取,否则阳性对照结果可能异常。
注:定量PCR八联管的封盖,应该佩戴全新的一次性PE手套进行操作,避免裸手接触定量PCR八联管。
表3. 荧光定量PCR扩增程序
步骤 作用 循环数 温度 时间 收集荧光信号
1 预变性 1 cycle 95 ℃ 30 sec 否2 预扩增(不收集荧光) 5 cycles 95 ℃ 10 sec 否60 ℃ 35 sec 否3 正式扩增(需要收集荧光) 40 cycles 95 ℃ 10 sec 否60 ℃ 35 sec 是
4.3 待测样品结果判断:
待测样品有可能出现以下4种组合:
表4. 待测样品管FAM通道和VIC通道可能组合
组合 FAM通道(测支原体) VIC通道(测内参) 支原体污染判断
1 S型曲线 S型曲线 支原体污染
2 S型曲线 直线 支原体污染
3 直线 S型曲线 无支原体
4 直线 直线 PCR被抑制,结果无效
待测样品管只要FAM通道有S型扩增曲线(组合1和组合2)就说明有支原体污染。因为外加的内参质粒mycoIC2分子数极少,如果支原体含量很大时,内参质粒的扩增会被彻底抑制,导致内参VIC通道无信号(组合2)。
如果待测样品管FAM通道呈直线,而VIC通道有S型曲线(说明:样品的DNA提取过程和PCR扩增过程均正常)(注:由于提取过程中,外加的内参质粒mycoIC2分子数极少,作为内参对照的VIC通道的Ct值会比较大),说明样品无支原体。
如果阳性对照管和阴性对照管结果正常,而待测样品管FAM通道和VIC通道均呈直线,说明PCR被抑制。如果样品是经过提取的,最可能原因是:DNA洗脱前,吸附膜中的乙醇没有挥发彻底(解决方法:洗脱前,将吸附柱放50-65℃烘箱至少15分钟)。如果样品是没有经过提取的,则样品本身含有抑制PCR的成分(解决方法:将样品进行DNA提取或者离心清洗)。此外,二者相同的可能原因有(此种情况发生概率很低,一般不需要考虑):内参质粒mycoIC2在运输和储存中有部分降解,导致回收或者加入的内参质粒mycoIC2分子偏少,导致内参VIC通道扩增失败(解决方法:将内参质粒mycoIC2的加入量增加到原来的2-4倍)。
注1:阳性结果需要结合扩增曲线(主要)和Ct值(次要)进行判断,不能只看Ct值(因荧光值的波动,个别阴性样品虽然扩增曲线基本呈直线,但可能会出现Ct值,此类样品不能判断为阳性。反之亦然:有些样品有S型曲线,但是因为荧光值波动,导致没有Ct值,此类样品不能判断为阴性)。
注2: 结果判断完后,将PCR八联管用自封袋密闭后,进行适当处理。
注意事项
1. 实验全过程,应该佩戴一次性手套操作。
2. 防DNA污染注意事项:
(1)强烈建议所有操作(特别是qPCR体系配制步骤和吸取试剂盒中试剂的时候)使用进口滤芯吸头(比如:Axygen滤芯吸头)进行操作,以免试剂被污染。如果没有滤芯吸头,至少应该使用新开封的吸头。
(2)必须确保使用的移液枪本身没有残留的支原体。因此,最好使用全新购买的移液枪。如果没有新购买的移液枪,至少应该使用以前没有进行过细胞操作的移液枪。因为进行过细胞培养的移液枪极有可能被含支原体的培养液污染(如细胞培养时,不小心将含支原体污染的培养液吸入移液枪的枪体内)。由于本试剂盒非常灵敏,移液枪中吸附的支原体有可能造成不必要的假阳性。
(3)样品前处理的各类吸头、离心管,以及吸取阳性对照DNA、待测样品DNA的吸头,务必小心处理,请将其装入含有半瓶水的带盖的、可密封的瓶子内,全部样品吸取完后,盖上瓶盖,以防止阳性DNA的挥发,造成环境的污染,进而造成假阳性。
(4)整个操作过程,最好不要说话,因为人的口腔和唾液都是带支原体的。
(5)反应后,请勿打开反应管的盖子,否则有可能造成检测环境的污染。结果判断完后,将其用自封袋密闭后,进行适当处理。
3. 实验室必须严格分房间操作(本试剂盒建议在有窗户、通风良好的普通房间内操作,请勿在密闭的房间操作。请勿在细胞培养间进行该步骤的操作,因为细胞培养间支原体污染概率很高):
试剂配制房间1:专门进行定量PCR体系的配制(建议该房间全部使用进口滤芯吸头。)
DNA提取房间2:专门进行支原体DNA的提取;
DNA加样房间3:专门进行定量PCR体系配制后,添加待测样品、阳性对照、阴性对照等操作;
PCR扩增房间4:进行实时荧光PCR扩增检测。
注:如果房间紧张,可以考虑将房间2、房间3合并在一个房间,而房间1和房间4必须独立。各房间物品(包括移液枪)均为专用,不得交叉使用。
4. 如果出现qPCR的扩增被细胞的代谢产物抑制时(qPCR结果:支原体通道和内参对照通道均无扩增曲线),可以采取以下几种措施:
1) 将取样的时间提前到换液后2天或3天,此时细胞上清的PCR扩增抑制物相对比较少,一般不会产生严重的抑制。据我们测试,换液后5天,PCR扩增抑制物就已经大量积累。
2) 用PBS对待测样品进行离心清洗,去除样品中的抑制物。具体方法如下:取1 mL细胞上清,先13000 rpm离心5 minutes,吸走950 μL上清;加PBS 950 μL,再次离心,吸走950 μL上清;再加PBS 950 μL,第三次离心,吸走全部上清,用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.5 重悬沉淀,95 ℃加热处理5 minutes,简单离心(1000 g,5 seconds)后,取上清进行检测。但是该方法有如下缺点:第一,如果样品支原体含量较少,离心清洗可能导致漏检,因为离心清洗过程中,可能导致支原体部分丢失。第二,个别样品,即使经过上述清洗也无法彻底去除抑制剂。
3) 使用支原体基因组DNA抽提试剂盒(推荐使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》),抽提细胞上清的支原体DNA后再进行PCR鉴定。
4) 使用本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》或者《发光法支原体检测试剂盒》进行检测,经测试,未发现这两种试剂盒会被细胞的代谢产物所抑制。
为了预防PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制的问题,也可以考虑将所有待测样品全部进行离心清洗或者DNA提取后,再使用本试剂盒进行检测。
5. 支原体检测样品可以分成两类:第一类,用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液,由于该条件非常适合支原体生长,培养数天后,支原体密度一般较高,可达107-9/mL,可以直接检测。第二类,低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品,由于这些样品即使有支原体污染,支原体含量一般很少,直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测,往往检测不出来。这些样品建议:(1)对样品的支原体进行离心浓缩或者使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》将支原体DNA浓缩提取,该两种方法大约可以将检测灵敏度继续提高10-100倍。该方法速度快,当天出结果,但是可靠性不如后面的培养法。(2)使用支原体液体培养基(必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基)培养3-7天后,再进行检测。具体方法请参考本公司《发光法支原体检测试剂盒》说明书中最后的注意事项部分。该方法速度较慢,需要3-7天,但是可靠性高。
6. 如何提高本试剂盒检测灵敏度:如果预期待测样品支原体含量较少(比如,低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等),可以采取以下几种措施:(1)通过使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》,将支原体DNA浓缩提取后再进行检测(提取过程还可以把所有可能的PCR抑制剂全部去除),大约可以将检测灵敏度提高10-100倍。(2)对支原体进行离心浓缩:取1 mL细胞上清,先13000 rpm(约16000 g)离心5 minutes,吸走全部上清,用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.5 重悬沉淀,95 ℃加热处理5 minutes,简单离心后(1000 g,5 seconds),取上清进行检测。该离心浓缩过程大约可以将检测灵敏度提高20倍。(3)如果样品是未经提取的,可以通过增加反应管中样品DNA的加入量,比如由原来的2 μL增加到18 μL,如此可以提高检测灵敏度9倍【注意:(A)没有提取纯化或者离心清洗的待测样品,不能直接扩大待测样品体积,否则PCR被抑制的可能性将大幅度增加;(B)如果确定要增加每个反应管中样品DNA的加入量,样品中内参质粒的加入量要成比例减少。比如原来样品DNA的加入量为2 μL ,则50 μL样品中需要加入4 μL内参质粒;如果改变后样品DNA的加入量为16 μL(原来8倍),则50 μL样品中只需加入0.5 μL内参质粒(原来1/8),以保持每个反应管中内参质粒的总加入分子数不变】。
7. 如发现细胞被支原体污染,本公司提供细胞专用支原体清除和预防试剂,以及水浴专用杀菌剂和环境专用杀菌剂。
8. 本试剂盒与Sigma公司的Lookout Mycoplasma qPCR Detection Kit(货号:MP0040A)原理一样,可以替代后者用于细胞培养上清的支原体检测。
《探针法支原体检测试剂盒》灵敏度测试
我们选取了上述20种支原体中比较有代表性的4种支原体(分别是:A. laidlawii,M.
pneumoniae,M. fermentans和M. orale),使用含相应支原体基因片段的质粒载体,经DNA定量后,计算出相应的分子数。
质粒经10倍系列稀释【从10^(-4)到10^(-11)】后,进行相应的qPCR扩增(每个稀释度做2个重复),其结果如下表所示:
说明:各支原体质粒10倍系列稀释的Ct值。每个稀释度做2个重复,每个反应管的DNA加入量为2μL。由表1可知:在每个反应管的DNA加入量为2μL的情况下,《探针法支原体检测试剂盒》对4种支原体的最高检测灵敏度(即检测下限)大约在4-16 copies,即2-8 copies/μL【具体请参考表1中,4种支原体质粒的10^(-10)稀释度的数据】。
注:《探针法支原体检测试剂盒》检测灵敏度详细数据,请参考其方法学报告。