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Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.



《支原体基因组DNA提取试剂盒》(离心柱法)说明书(版本200713)




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货号

​MG015


包装规格

50次/盒


储存条件

该产品常温运输,室温保存(收货后,其中的Proteinase K放-20˚C保存)。该条件下,至少3年内有效。Proteinase K溶液可以在室温保存6-12个月,长期保存需要放-20˚C。



产品简介

《支原体基因组DNA提取试剂盒》(离心柱法)(Mycoplasma Genomic DNA Extraction Kit with Columns)的操作方法和试剂配方已经针对支原体的特点做了优化,专门用于从体外培养的细胞、细胞上清、血清、血浆、全血、生物制品等样品中提取支原体基因组DNA。提取的支原体基因组DNA可用于《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》。

支原体基因组DNA的提取有两个作用:(1)可以去除所有可能抑制PCR扩增的成分或者干扰《一步法恒温支原体检测试剂盒》显色的成分,保证后续PCR扩增的正常进行或者《一步法恒温支原体检测试剂盒》的显色不被干扰;(2)具有浓缩支原体DNA的作用,可以提高相对检测灵敏度10-100倍。



产品组份(50次)


蛋白酶K溶液:Proteinase K(20 mg/mL)


溶液GR:Buffer GR, 15 mL


溶液GL:Buffer GL, 15 mL


清洗液GW1:Buffer GW1(Concentrate), 13 mL


清洗液GW2:Buffer GW2(Concentrate), 15 mL


洗脱液GE:Buffer GE, 15 mL


吸附柱:Spin Columns DM, 50个


收集管:Collection Tube, 50个


需自备的试剂和耗材:(1)无水乙醇;(2)1.5 mL离心管




操作步骤


1. 实验前准备及重要注意事项

    1) Buffer GW1和Buffer GW2的配制:第一次使用前,应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇,并在试剂瓶标签中做好标记。

    2) 使用前请检查Buffer GL是否出现结晶或者沉淀,如有结晶或者沉淀,请将Buffer GL于56˚C水浴孵育重新溶解。


2. 样品处理:

    1) 待测样品的选择:本试剂盒优选体外培养的细胞上清(贴壁细胞直接取细胞培养上清、悬浮培养细胞取低速离心后的离心上清)、血清、血浆、溶液型生物制品作为提取支原体基因组DNA的样品。如果是粉末型样品,需用水溶解后,再进行后续操作。

     注1:如果初始样品是体外培养的悬浮细胞,可以经1200 rpm(约150 g)低速离心5分钟后(切记:此步骤离心力不能太大,否则支原体会被离心去除了!),取离心后上清进行检测。如果细胞含量不是太多(少于500万个),也可以不低速离心,直接进行后续操作。

     注2:如果初始样品是加了抗凝剂的全血,可以经1200 rpm(约150 g)低速离心15分钟后(切记:此步骤离心力不能太大,否则支原体会被离心去除了!),取上层血浆进行检测。也可以不经过低速离心,直接取200 μL全血进行后续操作。

     注3:如果初始样品是未加抗凝剂的全血,待血液凝固后,取血清进行检测。


   2) 取上述细胞上清、血清、血浆、生物制品等样品200 μL,用移液枪吹吸均匀后,进行后续操作。

     注1:如果预期待测样品支原体含量较少(比如长期低温保存的血清、血浆、胰酶、生物制品等),可以取上述样品1 mL,加入1.5 mL离心管内,13000 rpm(约16000 g)高速离心 5 分钟。吸走离心后的上清800 μL,剩余200 μL用移液枪吹吸均匀后,进行后续操作。此步骤起浓缩支原体的作用,从而提高支原体检测的相对灵敏度。如果需要,上述样品的体积可以进一步放大,经过多次高速离心后,剩余200 μL用于后续操作(比如,如果初始体积是5 mL,经5次高速离心,取剩余的200 μL进行后续操作,最终用50 μL 洗脱液进行洗脱,则支原体DNA大约浓缩了100倍,支原体检测的相对灵敏度也大约提高了100倍。)

     注2:当样品量小于200 μL时,加入Buffer GR补足至200 μl,再进行下一步实验。


3. 向以上溶液中加入20 μL Proteinase K(20 mg/mL)溶液,混匀。


4. 加入200 μL Buffer GL,震荡彻底混匀。

     注意:不要将Proteinase K和Buffer GL进行预混,否则Proteinase K可能失活。


5. 将离心管放置56˚C水浴,孵育15分钟,其间每各3-5分钟颠倒混匀数次。

     注意:此步骤不能省略!孵育15分钟DNA的产量已经达到最大,继续延长孵育时间对DNA产量和纯度没有影响。


6. 加入200 μL无水乙醇,颠倒混匀数次。1000 rpm低速短暂离心,使管壁和壁盖上的液体集中到管底。


7. 将所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns DM)中,若一次不能加完溶液,可分多次转入。12,000 rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。


8. 向吸附柱中加入500 μL Buffer GW1(使用前检查是否加入无水乙醇!), 12,000 rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。


9. 向吸附柱中加入500 μL Buffer GW2(使用前检查是否加入无水乙醇!),12,000 rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。


10. 重复该步骤9。


11. 继续12,000 rpm离心2分钟,倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温5-10分钟(如果有条件,可以将吸附柱放入37-65˚C烘箱或培养箱),以彻底晾干,。

     注意:此步骤不能省略!这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会严重影响后续的酶促反应(酶切、PCR 等)。


12. 将吸附柱置于一个新的1.5 mL离心管(自备)中,向吸附柱的中间部位悬空加入50 μL Elution Buffer GE,室温放置3分钟,12,000 rpm离心1分钟,收集DNA溶液,-20℃保存。

     注1:本公司的Elution Buffer GE是经过优化的洗脱液,该洗脱液与本公司的所有基于核酸扩增技术的支原体检测试剂盒完美兼容(包括:一步法恒温支原体检测试剂盒,PCR法支原体检测试剂盒和探针法支原体检测试剂盒)。如果是其他公司DNA提取试剂盒的洗脱液,当反应体系中DNA量加大后(比如反应体系中DNA加入量由2 μL变为20 μL时)有可能会影响到核酸的正常扩增。

     注2:如果样品的初始体积分别是200 μL、1 mL或5 mL,经最后50 μL洗脱,则支原体DNA分别大约浓缩了4倍、20倍或100倍,支原体检测的相对灵敏度也大约提高了4倍、20倍或100倍。