​上海易色医疗科技有限公司

Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.

《BCA蛋白定量试剂盒》说明书（版本PG26）

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货号

储存条件

本试剂盒在常温保存。试剂盒内的BSA标准品，请放-20 ºC保存。

产品原理

BCA蛋白定量试剂盒（BCA Protein Assay Kit）是进行蛋白质浓度测定的最常见的方法之一。

BCA蛋白定量的主要原理是：蛋白质在碱性条件下，可以将二价Cu2+离子还原成一价Cu+离子。产生的一价Cu+离子可以与BCA（Bicinchoninic acid）试剂结合，最终生成紫色的复合物。该复合物在562 nm处有很强的吸收峰。复合物的多少与蛋白质的浓度呈接近的线性关系。

产品优点

​BCA蛋白定量试剂盒有许多优点：

1. 检测的灵敏度高，检测的蛋白质浓度下限可达20μg/mL。

2. 线性范围广，在20 - 2000μg/mL的范围内，呈接近的线性关系。

3. 兼容性良好，产品可以兼容的化学物质非常广泛（详细的兼容情况见附录）。

产品组成​

1. BCA试剂A: 500 mL.

2. BCA试剂B: 15 mL.

3. 蛋白标准品（BSA，2 mg/mL）：10 mL.

使用方法

1. BCA工作液的配制

（1）BCA工作液总体积的计算：

BCA工作液总体积 =（标准品数量+待测样品数量+1）× 重复数 × 200 μL。

举例：如果标准品数量为8，待测样品数量1，重复数为3，则BCA工作液总体积=（8+1+1）×3×200 μL=6000 μL

（2）BCA工作液的配制：按50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1），充分混匀。

举例：将5000 μL的BCA试剂A与100 μL的BCA试剂B混合，得到5100 μL的BCA工作液。

2. BSA标准品的配制

将BSA标准品做系列稀释，分别得到如下9个不同浓度的标准品：2000μg/mL，1500μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，0μg/mL。

注：严格的蛋白定量，BSA标准品的稀释溶液应该与待测蛋白样品的溶液相同。但是一般情况下，BSA标准品可以直接用0.9% 的NaCl、PBS或者去离子水进行稀释。

3. 取BSA标准品和待测样品各25μL到96孔板孔内，

注：正常情况下，样品与BCA工作液的体积之比应为1:8。如果样品体积有限，也可使用10μL BSA标准品和待测样品进行检测（即样品与BCA工作液的体积之比为1:20），这时BCA定量试剂盒的检测范围较小为125-2000 μg/mL。

4. 往每孔中加入200μL 的BCA工作液，盖上96孔板盖子。

5. 将96孔板放37 ℃，30分钟。

6. 用酶标仪测562 nm处的光吸收值。

注：562 nm为最强的光吸收波长。如果无法检测562 nm处的光吸收值， 也可以在540～595 nm波长范围内检测光吸收值。

7. 根据BSA标准品的光吸收值（扣除空白孔的光吸收值即为最终的读数），绘制标准曲线。依据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。

注意事项

1. 以上使用方法是根据96孔板进行设计的。此试剂盒也可以使用分光光度计进行测量。如果使用分光光度计测量562 nm处的光吸收值，则BSA标准品和待测样品的体积使用量应调整为0.1 mL，而BCA工作液的使用量应调整为 2 mL。

2. 使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量时，颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关。

3. 每次蛋白定量都需要重新做新的标准曲线，因为显色反应的颜色与温度和时间有关。

4. BCA试剂如果发现有细菌污染，则不能再使用。

本试剂盒与Thermo公司同类产品的比较

图1. 比较实验证明：上海易色BCA试剂盒与Thermo公司的BCA试剂盒（货号：23227）几乎完全一样。而我们的价格只是其价格的50%左右，具有超高的性价比。

附录

BCA蛋白定量兼容试剂列表1

Salts/Buffers Compatible Concentration

ACES, pH 7.8 25 mM

Ammonium sulfate 1.5 M

Asparagine 1 mM

Bicine, pH 8.4 20 mM

Bis-Tris, pH 6.5 33 mM

Borate (50mM), pH 8.5 undiluted

B-PER® Reagent undiluted

Calcium chloride in TBS, pH 7.2 10 mM

Na-Carbonate/Na-Bicarbonate (0.2 M), pH 9.4 undiluted

Cesium bicarbonate 100 mM

CHES, pH 9.0 100 mM

Na-Citrate (0.6 M), Na-Carbonate (0.1 M), pH 9.0 1:8 dilution with Water

Na-Citrate (0.6 M), MOPS (0.1 M), pH 7.5 1:8 dilution with Water

Cobalt chloride in TBS, pH 7.2 0.8 mM

EPPS, pH 8.0 100 mM

Ferric chloride in TBS, pH 7.2 10 mM

Glycine•HCl, pH 2.8 100 mM

Guanidine•HCl 4 M

HEPES, pH 7.5 100 mM

Imidazole, pH 7.0 50 mM

MES, pH 6.1 100 mM

MES (0.1 M), NaCl (0.9%), pH 4.7 undiluted

MOPS, pH 7.2 100 mM

Modified Dulbecco’s PBS, pH 7.4 undiluted

Nickel chloride in TBS, pH 7.2 10 mM

PBS; Phosphate (0.1 M), NaCl (0.15 M),

pH 7.2 (# 28372) undiluted

PIPES, pH 6.8 100 mM

RIPA lysis buffer; 50mM Tris, 150mM NaCl,

0.5% DOC, 1% NP-40, 0.1% SDS, pH 8.0 undiluted

Sodium acetate, pH 4.8 200 mM

Sodium azide 0.2%

Sodium bicarbonate 100 mM

Sodium chloride 1 M

Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4 200 mM

Sodium phosphate 100 mM

Tricine, pH 8.0 25 mM

Triethanolamine, pH 7.8 25 mM

Tris 250 mM

TBS; Tris (25mM), NaCl (0.15 M), pH 7.6 undiluted

Tris (25mM), Glycine (192mM), pH 8.0 1:3 dilution with Water

BCA蛋白定量兼容试剂列表2  

Detergents Compatible Concentration

Brij®-35 5.0%

Brij-56, Brij-58 1.0%

CHAPS, CHAPSO 5.0%

Deoxycholic acid 5.0%

Octyl β-glucoside 5.0%

Nonidet P-40 (NP-40) 5.0%

Octyl β-thioglucopyranoside 5.0%

SDS 5.0%

Span® 20 1.0%

Triton® X-100 5.0%

Triton X-114, X-305, X-405 1.0%

Tween®-20, Tween-60, Tween-80 5.0%

Zwittergent® 3-14 1.0%

Chelating agents

EDTA 10 mM

EGTA Incompatible

Sodium citrate 200 mM

Reducing & Thiol-Containing Agents

-acetylglucosamine in PBS, pH 7.2 10 mM

Ascorbic acid Incompatible

Cysteine Incompatible

Dithioerythritol (DTE) 1 mM

Dithiothreitol (DTT) 1 mM

Glucose 10 mM

Melibiose Incompatible

2-Mercaptoethanol 0.01%

Potassium thiocyanate 3.0 M

Thimerosal 0.01%

BCA蛋白定量兼容试剂列表3 

Misc. Reagents & Solvents    Compatible Concentration

Acetone 10%

Acetonitrile 10%

Aprotinin 10 mg/L

DMF, DMSO 10%

DMSO 10%

Ethanol 10%

Glycerol (Fresh) 10%

Hydrazides Incompatible

Hydrides (Na2BH4 or NaCNBH3) Incompatible

Hydrochloric Acid 100 mM

Leupeptin 10 mg/L

                                                                     BCA蛋白定量不兼容（Incompatible）试剂列表1

注：使用BCA试剂盒进行蛋白定量，应该尽量避免使用上述不兼容试剂。如果样品中含有上述试剂，可以通过透析、稀释、TCA沉淀等方法尽可能去除影响。