​上海易色医疗科技有限公司

Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.

二、本公司四种快速《支原体检测试剂盒》选购指南

  运输费和阳性对照说明

《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》采取冰袋运输或常温运输，每批货收取25元的快递运输费。

《发光法支原体检测试剂盒》和《发光法阳性对照》采取干冰运输，每批货收取150元的干冰运输费。

《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》本身含阳性对照，无需单独购买。

《发光法支原体检测试剂盒》本身不含阳性对照，《发光法阳性对照》（货号：LPC10；含40次，价格600元）需要单独购买。

《支原体基因组DNA提取试剂盒》（离心柱法）：50次/盒（货号：MG015），每盒650元。

本公司四款不同原理的快速《支原体检测试剂盒》的检测灵敏度比较

        为了比较本公司开发的四款不同原理的快速《支原体检测试剂盒》【分别是：《一步法恒温支原体检测试剂盒》（简称“一步法”）、《PCR法支原体检测试剂盒》（简称“PCR法”）、《发光法支原体检测试剂盒》（简称“发光法”）和《探针法支原体检测试剂盒》（简称“探针法”）】的检测灵敏度高低，我们使用了以下两种DNA作为模板：（1）含M. hyorhinis基因片段的质粒【由于“发光法”只能检测活菌，该模板只比较了另外三种试剂盒】；（2）经支原体液体培养基培养数天的M. hyorhinis支原体活菌（猪鼻支原体）。

​         说明：四款快速《支原体检测试剂盒》检测灵敏度比较。从本表可知：（1）“探针法”的检测灵敏度最高，其检测下限可以达到5.6-10.8 copies/2μL；（2）其次是“PCR法”，与“探针法”的最高检测灵敏度基本持平或略低一点；（3）“一步法”的检测灵敏度比“PCR法”和“探针法”都要低，其检测下限大约为22.5-172.3 copies/2μL；（4）“发光法”的检测灵敏度最低，其检测下限（即需要样品的发光值与阴性对照的发光值的比值大于1.2）大约为2200个活菌/μL【10^(-3)稀释度】。​

注：四款快速《支原体检测试剂盒》各自检测灵敏度详细数据，请参考各自的方法学报告。

  

三、本公司四种快速《支原体检测试剂盒》的具体选购步骤

首先，作为支原体检测领域的共识：单独使用目前市面上的任何一种支原体检测试剂盒，都无法做到100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。严格的支原体检测，至少需要使用两种，最好使用三种不同原理的支原体检测方法同时进行检测，才能使检测结果接近100%正确。如果几种不同支原体检测方法的检测结果一致，正确率几乎就是100%。

其次，您可以根据自己实验室的条件、检测时间长短、产品价格、支原体识别率、假阳性和假阴性概率、样品是否需要前处理等进行综合选择。

最后，因为上述四种《支原体检测试剂盒》中，只有《探针法支原体检测试剂盒》和《PCR法支原体检测试剂盒》的支原体识别率是100%，如果同时选择两种以上支原体检测试剂盒，我们建议其中一种选择《探针法支原体检测试剂盒》（货号：GM016）或者《PCR法支原体检测试剂盒》（货号：PM008。本试剂盒由于含内参条带：可以区分真阴性样品和假阴性样品）。

如果您实验室已经拥有（或者打算购买，注：可以考虑购买国产仪器，10万以内）荧光定量PCR仪，我们强烈推荐您选择《探针法支原体检测试剂盒》，《探针法支原体检测试剂盒》具有100%支原体识别率、最高的检测灵敏度和最高的检测正确率等一系列优点，该方法被认为是支原体快速检测的金标准。单独使用《探针法支原体检测试剂盒》一种方法进行支原体检测的准确率就可以达到同时使用其他两种不同原理的支原体检测方法所能达到的准确率。

以上四款支原体快速检测试剂盒单独使用的检测正确率排序：最高的是《探针法支原体检测试剂盒》（接近100%）；其次是《PCR法支原体检测试剂盒》（在排除假阳性和假阴性后，接近100%）；再次是《发光法支原体检测试剂盒》（99%左右）和《一步法恒温支原体检测试剂盒》（98-99%左右）。

如果您想得到100%正确的支原体检测结果（比如，开展细胞治疗的客户，进行干细胞培养的客户，生产血清、胰酶、培养液的客户，出售各种原代培养细胞系和肿瘤细胞系的客户等），任选本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》中的两种进行检测，将会得到比较满意的结果。如果几种不同支原体检测方法的检测结果一致，正确率就几乎是100%。

    如果将所有待测样品统一接种到支原体液体培养基【必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的支原体液体培养基】，然后在37℃培养箱中培养3-7天后，再用2-3种不同原理支原体检测试剂盒同时进行检测，则基本可以确保您的检测结果100%正确！通过将待测样品接种到支原体液体培养基培养3-7天的目的是：防止一些支原体含量极其微量的待测样品（比如：细胞培养用的血清、胰酶、抗生素、培养液和极个别的细胞培养上清），如果不经过大量繁殖，有可能漏检。

        注意：发光检测（Luminescence）与荧光检测（Fluorescence）、吸收光检测（Absorbtance）是不同的功能。吸收光检测即最常用的OD值检测。荧光检测（比如常见的FITC检测）需要激发光，而发光检测（如荧光素酶的活性检测）不需要激发光。多功能酶标仪常见的检测功能有：吸收光检测、荧光检测和发光检测，三种功能为独立的功能。您如果不清楚您实验室的酶标仪是否具有发光检测功能，请咨询您的实验室主任或者酶标仪厂家。

支原体检测样品的分类：

支原体检测样品可以分成两类：

     第一类：用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液，由于该条件非常适合支原体生长，培养数天后，支原体密度一般较高，可达10^7-9/mL（即每微升10^4-6copies，数据来自参考文献4），可以直接检测。

     第二类：低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品，由于这些样品即使有支原体污染，支原体含量一般很少(比如:1毫升就只有几个)，如果直接检测，漏检可能性较大。这些样品建议：（1）对样品的支原体进行离心浓缩或者使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》将支原体DNA浓缩提取，该两种方法大约可以将检测灵敏度继续提高10-100倍。该方法速度快，当天出结果，但是可靠性不如后面的培养法。（2）使用支原体液体培养基（必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基）培养3-7天后，再进行检测。具体方法请参考本公司《发光法支原体检测试剂盒》说明书中最后的注意事项部分。该方法速度较慢，需要3-7天，但是可靠性高。

关于支原体检测试剂盒灵敏度的问题

针对上述两种类型的支原体检测样品：

      对于第一类样品（用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液），由于其支原体密度一般较高，可达10^7-9/mL（即每微升10^4-6copies，数据来自参考文献4），选用本公司生产的上述任何一种支原体检测试剂盒，其灵敏度一般都没有问题（细胞上清中的支原体密度一般已经大于检测的灵敏度下限）。

      对于第二类样品（低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等），由于这些样品即使有支原体污染，支原体含量一般很少(比如:1毫升就只有几个)，如果直接检测，漏检可能性较大。这些样品强烈建议使用支原体液体培养基（必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基）培养3-7天后再进行检测。培养后，由于支原体含量已经大幅度提升，选用本公司生产的上述任何一种支原体检测试剂盒，其灵敏度都没有问题。【对于第二类样品的折中方法是：对样品的支原体进行离心浓缩或者使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》将支原体DNA浓缩提取，该两种方法大约可以将检测灵敏度继续提高10-100倍。该方法速度快，当天出结果，但是可靠性不如后面的培养法。】

  所以：总体来说，只要样品分别按照上述两种方法进行操作（细胞上清直接检测，其他预期支原体密度很低的样品用支原体液体培养基培养3-7天后检测），支原体检测的灵敏度都不是问题。

如果使用PCR法检测支原体，完全没有必要选用所谓的《巢式PCR法支原体检测试剂盒》（详见下文介绍），使用巢式PCR法检测支原体有三个缺点：（1）该方法一般不带内参对照，无法区分真阴性样品和假阴性样品；（2）整个检测过程耗时太久，往往需要6-8小时；（3）由于经过两轮PCR扩增，极易产生假阳性。使用本公司生产的《PCR法支原体检测试剂盒》其灵敏度已经可以达到每微升10个copies左右，已经完全可以满足细胞培养上清液中支原体检测的灵敏度需求。

四、各公司《PCR法支原体检测试剂盒》选购注意事项 

目前，PCR法支原体检测仍然是支原体快速检测领域被客户选购最多的方法。目前，商业化的PCR法支原体检测方法就有好几种，各优缺点分述如下：

 （1）不带内参基因的普通PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有2条引物，不带内参基因。通过30-35轮的普通PCR直接检测。需要通过琼脂糖电泳分析检测结果，整个检测过程耗时3-4小时。缺点：无法区分真阴性样品和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品（二者，支原体特异条带均为阴性）。

 （2）带内参基因的普通PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有2条引物，带内参基因。通过30-35轮的普通PCR直接检测。需要通过琼脂糖电泳分析检测结果，整个检测过程耗时3-4小时。优点：可以区分真阴性样品（内参条带为阳性而支原体特异条带为阴性）和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品（内参条带和支原体特异条带均为阴性）。

 （3）巢式PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有4条引物，一般不带内参基因。第一轮，用2条外引物通过30轮的PCR扩增后；第二轮，取少量第一轮的扩增产物作为模板，用2条内引物再进行30轮的PCR扩增。需要通过琼脂糖电泳分析检测结果，整个检测过程耗时6-8小时。缺点：耗时太久，容易产生假阳性、也无法区分真阴性样品和假阴性样品。

 （4）不带内参基因的荧光定量PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有2条支原体特异性引物及相应荧光探针，不带内参基因。通过40-45轮的定量PCR检测。无需通过琼脂糖电泳分析检测结果，整个检测过程耗时2小时左右。缺点：如果样品有不经过DNA提取，则无法区分真阴性样品和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品（二者，均显示为没有扩增）。

 （5）带内参基因的荧光定量PCR法支原体检测试剂盒。该试剂盒含有2条支原体特异性引物和2条内参引物及各自荧光探针。通过40-45轮的定量PCR检测。无需通过琼脂糖电泳分析检测结果，整个检测过程耗时2小时左右。优点：可以区分真阴性样品（内参检测荧光通道为阳性而支原体检测荧光通道为阴性）和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品（内参检测荧光通道和支原体检测荧光通道均为阴性）。

由于PCR法支原体检测过程中，PCR的扩增可能会被细胞的代谢产物抑制的问题，是该方法的致命弱点。Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit（货号MP0035）的PCR法支原体检测试剂盒说明书中也特别提到了这点，说明这是一个PCR法支原体检测中经常遇到的问题，其强烈建议用试剂盒进行DNA提取后再进行鉴定。

 上述5种PCR支原体检测方法中，只有方法（2）和（5）可以区分真阴性样品和由于细胞代谢产物抑制导致的假阴性样品。所以，大家选购各公司的PCR法支原体检测试剂盒时，如果不打算进行样品DNA的提取，尽量选取含内参基因的上述方法（2）类和（5）类的支原体检测试剂盒，比如：本公司的《PCR法支原体检测试剂盒》（货号：PM008）和本公司的《探针法法支原体检测试剂盒》（货号：QM016）。

PCR法检测体外培养细胞的支原体时，PCR扩增可能会被细胞代谢产物抑制，从而导致假阴性结果：

（截图来自Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，货号MP0035说明书）

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五、支原体污染细胞的危害（1）​

​培养的细胞被支原体污染后，几乎可以改变细胞的所有功能，其可以导致细胞染色体的异常和损伤，改变细胞的代谢、生长、形状、附着，影响病毒的扩增能力和产量等等。例如，Miller CJ等人通过Microarray的研究表明：支原体污染严重改变被污染细胞的基因表达谱 [1, 2]，支原体污染后与无污染的同一细胞系相比，表达差异达2倍以上的基因就有200多个！！！（详细数据请见参考文献 1）。Edward Burnett 和 Liz Penn认为：被支原体污染的细胞系已经不是原来的细胞系，而是另外一个细胞系了 [3]！此外，严重的支原体污染将彻底摧毁一株细胞系。

从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。

​总之，在细胞系上进行生物医学方面的科学研究，如果不能保证所用的细胞系无支原体污染（Mycoplasma-free），则所得出的结论是极端不可靠甚至是完全错误的！可以想象：全球范围内，每年因支原体污染导致白白浪费的科研经费的数量是多么的巨大，有人估计至少高达数十亿美金！

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​​​​​​​​​支原体污染细胞的危害（2）​​​​​​​​

1.       细胞生物学：支原体污染将直接导致最常用的MTT细胞毒性实验结果的严重错误！

 

  结果：由于支原体对MTT的额外还原作用，对阿霉素（Doxorubicin, 一种抗肿瘤药物）的抗性，支原体污染和非污染的细胞二者相差15倍！（Due to an additional reduction of tetrazolium by mycoplasmas, contaminated cells appeared up to 15 fold resistant to doxorubicin.）

  参考文献：Falsification of tetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assay results due to mycoplasma contamination of cell cultures. Anticancer Res. 1999 Mar-Apr; 19(2A):1245-8.

 

2.       免疫学：支原体污染本身将可以直接诱导树突状细胞的成熟！这对于目前国内外普遍开展的人体免疫细胞的肿瘤治疗将是灾难性的。

 

结果：（1）The capacity of these cell lines to induce DC maturation was due to their contamination by mycoplasma. Our results reveal that DC are able to sense mycoplasma infection and mature as they do in response to most viruses and bacteria.（2）Further investigation demonstrated that the changes in DC phenotype and functions were due to the presence of mycoplasmas in these two cell lines; eradication of mycoplasmas completely abolished the observed effects, and importantly, pure mycoplasmas in the absence of tumor cell supernatants were able to produce the same effects.

参考文献：（1）Dendritic cell maturation is induced by mycoplasma infection but not by necrotic cells. Eur. J. Immunol. 2000.30: 705–708。（2）Mycoplasma-mediated alterations of in vitro generation and functions of human dendritic cells. J Biomed Sci. 2005;12(1):31-46.

 

3.       神经生物学：支原体污染本身可以直接降解淀粉样多肽Amyloid-beta (Abeta)！

 

结果：These data show that mycoplasmas degrade Abeta and thus may represent a significant source of variability when comparing extracellular Abeta levels in different cell lines.

参考文献：（1）Amyloid-beta peptide degradation in cell cultures by mycoplasma contaminants. BMC Res Notes. 2008 Jun 30;1:38.（2）Neuroprotective effects of Mycoplasma hyorhinis against amyloid-β-peptide toxicity in SH-SY5Y human neuroblastoma cells are mediated by calpastatin upregulation in the mycoplasma-infected cells. Neurochem Int. 2011 Mar;58(4):497-503.

 

4.       生物化学：支原体污染可以直接影响L-arginine的代谢！

 

结果：This demonstrates that infection with M. hyorhinis leads to different effects on gene regulation of the murine and human iNOS gene. Our study underlines the importance of routine checking of cell cultures for mycoplasma contamination, particularly in studies on NO-mediated effects or inflammatory processes.

参考文献: Impact of Mycoplasma hyorhinis infection on L-arginine metabolism: differential regulation of the human and murine iNOS gene. Biol Chem. 2005 Oct;386(10):1055-63.

 

5.       病理学：支原体污染可以直接刺激前列腺素E2（Prostaglandin E2）的产生！

 

结果：Mycoplasma fermentans (MF) also stimulated PGE(2) production. The co-infection of mycoplasma and Chlamydia resulted in an additive effect in the production of PGE(2). Thus it is important to use host cells and Chlamydia free of mycoplasma contamination for the analysis of Chlamydia-induced prostaglandin production.

参考文献:Production of prostaglandin E2 in monocytes stimulated in vitro by Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, and Mycoplasma fermentans. Microb Pathog. 2004 Sep;37(3):155-61.

 

​六、如何获得100%正确的支原体检测结果？

可以说，到目前为止，针对体外细胞培养的支原体检测的方法还没有一种单独使用就可以保证100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。

（1）支原体固体培养法。通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落，而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20-50%。这就意味支原体固体培养法漏检率高达20-50%。

（2）PCR法。PCR法导致的假阳性大家比较熟悉，无需多说。值得注意的是，由于细胞培养液中，经常会含有强烈抑制PCR扩增的代谢产物，如果不进行样品的前处理而直接使用细胞培养原液进行PCR检测，产生假阴性的概率是非常大的。

（3）荧光染色法。由于该方法本身的灵敏度较低，轻度的支原体污染往往无法检测出来。该方法漏检率也不会低。

（4）检测支原体特异性酶的方法，比如Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit和本公司生产的《发光法支原体检测试剂盒》。主要缺点是发光值有一定的波动，处于检测下限边缘的读值可能会造成误判。

（5）《一步法恒温支原体检测试剂盒》该方法尽管有许多优点，但是目前为止，我们只能保证该试剂盒能检测出说明书上列举的13种支原体，虽然这13种支原体大约占了所有污染细胞的支原体种类的99%左右，但是该方法也不能保证100%的支原体检出率。

        综上所述，单独使用目前市面上的任何一种支原体检测试剂盒，都无法做到100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。严格的支原体检测，至少需要使用两种，最好使用三种不同原理的支原体检测方法同时进行检测，才能使检测结果接近100%正确。

        如果您想得到100%正确的支原体检测结果（比如，开展细胞治疗的客户，进行干细胞培养的客户，生产血清、胰酶、培养液的客户，出售各种原代培养细胞系和肿瘤细胞系的客户等），任选本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》中的两种进行检测，将会得到比较满意的结果。如果几种不同支原体检测方法的检测结果一致，正确率几乎就是100%。

七、 ​支原体相关知识简介

​​​（1）支原体简介：

支原体（Mycoplasma）是一种没有细胞壁的原核生物，大小约0.3- 0.8微米。目前，已发现的支原体品种有100多种。其中，有近20种曾经在各种细胞培养体系中检测到，但超过98%以上的支原体污染是由6-8种引起的（注：具体的支原体种类，《一步法恒温支原体检测试剂盒》说明书中有详细介绍）。而且同一种细胞经常被多种支原体污染。

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（​2）支原体污染细胞的途径：

由于支原体直径较小，经常可以穿过实验室常规的0.20微米孔径的除菌滤膜，高压过滤时，甚至可以穿过0.10微米孔径的除菌滤膜,造成细胞的支原体污染。

细胞培养的支原体污染来源主要有：（1）细胞之间的交叉污染，这是支原体污染的最主要原因；（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等。（3）细胞培养用的组分，如血清、培养液等。

​（3）细胞支原体污染的隐蔽性：

由于支原体体积比细菌小很多，通常支原体污染密度非常的高，可达10^7-9/mL培养液，但即使这么高密度的支原体污染也无法通过普通显微镜的肉眼观察进行判断。

 而且，轻度到中度的支原体污染并不会导致细胞形态或生长速度的明显改变，也不会明显改变培养液的浑浊度或培养液的pH值。

 以上两个原因就导致体外培养的细胞即使被支原体污染了，一般的科研工作者也不会觉察到。也就是说：如果不进行支原体的常规检测，你甚至不知道你培养的细胞被支原体污染了，而污染的支原体却在悄悄改变你的实验数据和实验结果，你却被蒙在鼓里！

（4）​支原体污染细胞的比例：

据Corning公司报道，世界各国的细胞系都有不同程度的支原体污染,可以说支原体污染是细胞培养领域的一个世界性问题 [4]。表1是美国ATCC、FDA、以及其他两家细胞检测机构的支原体污染统计数据。表2是世界各国的细胞系污染比例。目前，世界各国细胞系支原体污染的平均比例为30-60%。

     表1，细胞支原体污染统计结果，数据来自参考文献 [4]

表2，世界各国的细胞系污染比例，数据来自参考文献 [4]

​​参考文献：

1.     Miller CJ, Kassem HS, Pepper SD, Hey Y, Ward TH, Margison GP. Mycoplasma infection significantly alters microarray gene expression profiles. Biotechniques. 2003 Oct;35(4):812-4.

2.    Aldecoa-Otalora E, Langdon W, Cunningham P, Arno MJ. Unexpected presence of mycoplasma probes on human microarrays. Biotechniques. 2009 Dec;47(6):1013-5.

3.     Edward Burnett and Liz Penn, European Collection of Cell Culture (ECACC®). Mycoplasma Detection and Elimination. Don Finley, Market Segment Manager, Sigma® Life Science. Biofiles, Vol. 8, No. 18

4.     John Ryan (2008). "Understanding and Managing Cell Culture Contamination". Corning Incorporated. 1-24.

八、如何检测血清是否含有支原体污染？

      血清有没有支原体污染这是细胞培养用户非常关心的问题。其检测方法有相当的特殊性，现介绍如下：

1. 必须认识到血清不适合直接检测，在对其进行检测之前，必须将其中可能含有的支原体进行大量的繁殖。这是因为：商品化的血清都是经过0.1 μm的滤膜多次过滤的而且长期低温保存和运输，其中即使含有支原体，其含量也必然是极其微量的（比如1 mL就含有几个支原体），直接检测一般是检测不出来的。【该类样品折中的方法是：使用本公司《支原体基因组DNA提取试剂盒》，将支原体DNA浓缩提取后再进行检测，大约可以将检测灵敏度继续提高10-100倍。该方法速度快，当天出结果，但是可靠性不如培养法。】

2. 血清样品中支原体的繁殖方法：分别取1 mL的血清，按1:10稀释到2种不同的支原体液体培养基（其中一种不含精氨酸，另外一种含精氨酸）中【注意：（1）因为每种支原体的营养需求不一样，2种支原体液体培养基都必须同时接种和培养；（2）血清接种的量不能太小，一般接种不少于1 mL，否则可能漏检；（3）不能使用常规的哺乳动物细胞培养液代替支原体液体培养基。因为经我们测试：在没有动物细胞共培养的情况下，支原体在含10%血清的动物细胞培养液如DMEM、1640、 MEM、GMEM中繁殖非常缓慢，甚至完全不繁殖。】，然后部分放4 ℃冰箱，部分放37 ℃二氧化碳培养箱或者普通的细菌培养箱中培养3-7天【对于生长速度快的支原体，3天的培养已经足够；对于生长速度慢的支原体，培养的时间可以适当延长】。3-7天后，进行支原体的检测【建议培养3天和7天后各检测一次】。

3. 培养3-7天后的样品中支原体的检测方法，可以在本公司《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》中任选1-3种进行检测。由于，血清是否含有支原体，事关重大，我们建议至少同时使用两种（最好使用三种）方法进行检测（其中一种我们推荐使用含内参对照的《PCR法支原体检测试剂盒》或者选择《探针法支原体检测试剂盒》，因为只有这两种试剂盒支原体识别率达到100%）。

4. 如果选择《发光法支原体检测试剂盒》进行检测，具体操作如下：以放4 ℃冰箱的含10%待测血清的支原体液体培养基作为阴性对照，用《发光法支原体检测试剂盒》检测培养箱中培养3天的培养液，其发光值是否明显增高，从而判断最初加入的血清是否含支原体。

5. 当然，培养3-7天后的样品，也可以用《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》或《探针法支原体检测试剂盒》进行检测。用这即种方法进行检测时，建议同时检测原液和1:10的稀释液，稀释液用PBS。这是因为：（1）原液仍然含有10%的血清，其仍然有可能抑制PCR的扩增；（2）一个样品同时检测两个稀释度，对于结果判断的准确性非常有帮助。结果判断如下：（1）如果两个稀释度的检测结果都为阴性，说明血清没有支原体污染；（2）两个稀释度的检测结果只要一个为阳性，说明血清有支原体污染，而且极有可能是污染了活支原体。最常见的结果是两个稀释度都为阳性或两个稀释度都为阴性。

6. 本公司同时提供2种支原体液体培养基（干粉型）产品，其中一种不含精氨酸，另外一种含精氨酸。大家购买后，自己按说明书配成支原体液体培养基，其中的马血清可以不加，而用待测的胎牛血清代替（终浓度10%即可）。其中的青霉素可以不用添加或者用细胞培养用的青霉素和链霉素（100×，按1:100加入）代替。1瓶支原体液体培养基（干粉型）大约可以检测1000个血清样品。

7. 如果大家觉得上述检测非常繁琐，本公司同时供应经上述步骤严格检测，证明100%不含活支原体的精选进口胎牛血清。

其他：如何检测胰酶、抗生素、未使用的动物细胞培养液等细胞培养相关试剂是否含有支原体污染？

这些样品也不适合直接检测。方法与血清的检测方法非常类似，在对其进行检测之前，也必须将其中可能含有的支原体进行大量的繁殖。首选，必须先检测支原体液体培养基中含有的血清是否被支原体污染，在保证血清没有支原体污染的前提下，配制含10%经证明没有支原体污染的血清的支原体液体培养基，然后将不少于1 mL的胰酶、抗生素或者动物细胞培养液等按1:10稀释到该培养基中，然后部分放4 ℃冰箱，部分放37 ℃二氧化碳培养箱或者普通的细菌培养箱中培养3-7天，3-7天后的进行支原体的检测，方法同上。

九、细胞支原体污染重要文献介绍​

 (1) Falsification of tetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assay results due to mycoplasma contamination of cell cultures.

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 (2) Dendritic cell maturation is induced by mycoplasma infection but not by necrotic cells.

 (3) Mycoplasma-mediated alterations of in vitro generation and functions of human dendritic cells.

 (4) Amyloid-beta peptide degradation in cell cultures by mycoplasma contaminants.

 (5) Neuroprotective effects of Mycoplasma hyorhinis against amyloid-β-peptide toxicity in SH-SY5Y human neuroblastoma cells are mediated by calpastatin upregulation in the mycoplasma-infected cells.

 (6) Impact of Mycoplasma hyorhinis infection on L-arginine metabolism: differential regulation of the human and murine iNOS gene.

 (7) Production of prostaglandin E2 in monocytes stimulated in vitro by Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, and Mycoplasma fermentans.

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 (8) Mycoplasma hyorhinis-Contaminated Cell Lines Activate Primary Innate Immune Cells via a Protease-Sensitive Factor.

 (9) Mycoplasma Infection Alters Cancer Stem Cell Properties in Vitro.

 (10) Metabolomics reveals mycoplasma contamination interferes with the metabolism of PANC-1 cells.

十、本公司《探针法支原体检测试剂盒》与中国药典收录的支原体液体培养法的灵敏度比较文章：

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